重组腺病毒介导的ING-4用于人MCF-7乳腺癌细胞的体外基因治疗

吴乙夫，董晓强

重组腺病毒介导的ING-4用于人MCF-7乳腺癌细胞的体外基因治疗

吴乙夫，董晓强

作者单位:215006江苏苏州，苏州大学附属第一医院普外科

目的研究重组腺病毒介导的ING-4感染人MCF-7乳腺癌细胞后对其的生长抑制作用。方法将搭载有ING-4基因的重组腺病毒载体Ad-ING-4感染人MCF-7乳腺癌细胞，用荧光显微镜、RTPCR和Western-Blot法检测ING-4在MCF-7细胞中的转录和表达;CCK法与流式细胞技术检测ING-4基因对MCF-7细胞的生长抑制和促凋亡作用;半定量RT-PCR法检测ING-4基因表达对MCF-7细胞中相关凋亡基因表达的影响。结果在MCF-7细胞中ING-4基因的表达对其细胞增殖有明显抑制作用，并显著促进其凋亡，ING-4表达使MCF-7细胞中Bax表达上调，Bcl-2、Survivin表达下调。结论MCF-7细胞在转染ING-4基因后其增殖受到了明显抑制，且更易凋亡，可能是通过改变Bax，Bcl-2及Survivin表达水平来实现。

ING-4基因;腺病毒载体;MCF-7人乳腺癌细胞;凋亡

乳腺癌在世界女性癌症死因中占很高比率，在近几十年里中国的乳腺癌发病率与病死率呈持续上升的趋势［1］。化疗一直是乳腺癌患者术后常规使用的治疗方法之一，但化疗后期经常因肿瘤细胞对化疗药物产生耐受而导致治疗失败。主要的原因可能是MDR-1基因的过度表达导致肿瘤细胞表面膜蛋白P-gp表达增加，从而促进胞内的化疗药物外排［2］。肿瘤细胞的耐药也与细胞的程序性死亡调控障碍有关，其常伴有促凋亡基因表达的降低与抗凋亡基因表达的升高［3］。ING为肿瘤生长抑制因子家族，其最早发现的成员有ING-1～ING-5，其抑癌作用与细胞周期调控、促进细胞凋亡、细胞DNA修复均有密切联系，其中ING-4引起了人们越来越多的注意。大量研究已经表明在各种不同类型的肿瘤细胞中均有ING-4基因的表达下调［4-7］、缺失［5，8］或突变［9-10］。在乳腺癌细胞中经常出现ING-4的表达缺失，且ING-4能抑制IL-6、IL-8等促血管生成因子的生成，并且抑制NF-κB及缺氧诱导因子HIF-1α的激活从而抑制肿瘤内的血管生成。与此同时，ING-4对于肿瘤的增殖、迁移与侵袭亦有抑制作用。基于ING-4基因治疗对人MCF-7乳腺癌细胞的抑癌效果尚未有人报导，在此项研究中，我们探索了ING-4表达水平与乳腺癌疾病进展的潜在联系。根据随后的实验及所得数据评估ING4基因疗法对乳腺癌细胞的抑癌效果同时推测其作用机制。

1　材料

重组腺病毒Ad-hING4-His（GFP+），空腺病毒Ad（GFP+）、QBI-293A细胞、MCF-7细胞均由本实验室保存，DMEM高糖培养基（Hyclone），小牛血清（杭州四季青），Taq DNA聚合酶、dNTPmix、DNA marker、Oligo（dT）18（TaKaRa），UNIQ柱式总RNA抽提试剂盒（上海生工生物技术有限公司），逆转录酶MMLV（MBI），CCK-8（cell counting kit-8）（日本同仁化学研究所），羊源性抗人ING-4多克隆抗体，兔抗羊IgG HRP二抗（钮英伦生物技术有限公司），蛋白印迹法化学发光试剂盒和暗盒（上海普利莱基因技术有限公司）。

2　方法

2.1Ad-ING-4作用后MCF-7人乳腺癌细胞形态学观察将处于对数生长期的MCF-7细胞设为三组:实验组（100 M的Ad-ING-4组）、空病毒对照组（100 M的Ad-GFP组）、阴性对照组（DMEM组）。于37℃、5%CO2条件下培养72 h后在倒置显微镜及倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。

2.2CCK-8法测定MCF-7细胞的多药耐药性按CCK-8试剂盒说明操作检测不同浓度化疗药物对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒作用，在96孔培养板内每孔加入105个/ml细胞的单细胞悬液100 μl，培养24 h后，更换新的培养基，倍比稀释加入不同浓度的药物（阿霉素、5-Fu、环磷酰胺），每一种浓度重复5孔，对照组分别加入等体积的Ad-GFP和PBS，放置于37℃5%CO2温箱中继续培养48 h，更换培养基，每孔加入10 μl CCK-8继续培养2 h，酶标仪检测450 nm波长的各孔吸光度（obtical density OD）值。每组分别去除一个最大OD值和最小OD值，取剩下3个平行孔的平均OD值计算细胞抑制率。以药物浓度为横轴，细胞抑制率为纵轴，绘制浓度效应曲线，求得半数抑制浓度（IC50）。实验重复3次。

2.3RT-PCR检测ING-4基因在MCF-7人乳腺癌细胞中的表达用100 M的Ad-ING-4和Ad-GFP病毒分别感染MCF-7细胞72 h后，收集细胞，PBS洗涤2～3次，按试剂盒说明书要求提取细胞总RNA，用引物ING-4-F、ING-4-R进行RT-PCR鉴定。PCR反应条件为94℃4 min，94℃50 s，58℃50 s，72℃1 min，30循环;72℃10 min，最后各取10 μl产物与DNA Marker一起行琼脂糖凝胶电泳。

2.4RT-PCR法检测MCF-7人乳腺癌细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、survivin的表达将呈对数生长的MCF-7细胞分为3组，实验分组同2.1，处理方法同2.3，感染病毒72 h后按试剂盒说明步骤抽提细胞总RNA，经逆转录，获得cDNA。将cDNA模板加入Bax上下游引物及Bcl-2上下游引物进行PCR反应，引物序列见表1。反应条件为94℃4 min，94℃50 s，56℃50 s，72℃1 min，30循环，72℃10 min，PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳。

表1　RT-PCR所用相关引物及其序列

2.5Western Blot检测ING-4基因在MCF-7细胞中的蛋白表达按方法2.3确定的腺病毒合适感染剂量（100 M）感染MCF-7/ADR细胞，感染Ad-ING-4为实验组，Ad-GFP和PBS为对照组。感染72 h后收集细胞，1 500 r/min，离心5 min收集细胞，PBS洗涤2～3次，各组细胞在裂解缓冲液中裂解。蛋白样品在10%SDS-PAGE胶中电泳分离，再将凝胶蛋白转印到PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入羊抗人ING-4抗体（1∶1 000），37℃2 h，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG二抗，再用，TBST洗膜5 min×3次，最后加化学发光底物（ECL），保鲜膜包裹后，于暗室内以ECL进行显色。

2.6流式细胞技术检测Ad-ING-4对MCF-7人乳腺癌细胞凋亡的影响根据2.2测出的IC50值作为加药组的加药量参考依据，将呈对数生长的MCF-7细胞分为6组:100 M Ad-ING-4加入半数抑制浓度的阿霉素（Ad-ING-4+ADR组）、100 M Ad-ING-4（Ad-ING-4组）、半数抑制浓度的阿霉素（ADR组）、100 M Ad-GFP（Ad-GFP组）、100 M Ad-GFP加入半数抑制浓度阿霉素（Ad-GFP+ADR组）、PBS阴性对照组。37℃，5%CO2条件下培养72 h后，分别收集6组细胞，PBS洗2遍细胞，按照凋亡试剂盒处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡，实验重复3次。

2.7统计学方法对所取得的数据运用SPSS16.0统计软件包进行分析，P＜0.05为有统计学意义。

3　结果

3.1Ad-ING-4在MCF-7细胞中的转染感染Ad-ING-4腺病毒24 h、48 h、72 h的MCF-7细胞荧光图见图1，由图1示，随Ad-ING-4感染作用时间的延长，MCF-7细胞变圆、脱落、皱缩、聚集等现象愈加明显，细胞贴壁数量明显减少。

图1　感染Ad-ING-4腺病毒24 h（A）、48 h（B）、72 h（C）的MCF-7细胞荧光图（×200）

3.2Ad-ING-4对MCF-7细胞的化疗多药耐药性的影响具体结果见图2，实验组（Ad-ING-4）对ADM、5-Fu及CTX的IC50值明显低于对照组（Ad-GFP及PBS），有显著差异（均P＜0.05），对照组间的IC50值无显著差异（P＞0.05）。

图2　Ad-ING-4对MCF-7细胞的化疗多药耐药性的影响

图3　Ad-ING-4感染后的MCF-7细胞的ING-4基因及凋亡相关的Bax、Bcl-2、Survivin基因表达的变化

3.3Ad-ING-4感染后的MCF-7细胞的ING-4基因及凋亡相关的Bax、Bcl-2、Survivin基因表达的变化

具体结果见图3，Ad-ING-4感染MCF-7细胞72 h后，与空白对照组和Ad-GFP组相比，Ad-ING-4能使MCF-7细胞Bax的表达水平明显上调（均P＜0.05），Bcl-2、Survivin的表达水平明显下调（均P＜0.05），Bax/Bcl-2的比值显著提高（均P＜0.05）。

3.4Ad-ING-4感染后的MCF-7细胞的ING-4基因相关蛋白的表达具体结果见图4，Ad-ING-4感染MCF-7细胞72 h后，与空白对照组和Ad-GFP组相比，Ad-ING-4实验组的ING-4蛋白表达水平有显著差异（均P＜0.05）。

3.5Ad-ING-4对MCF-7细胞的凋亡率的影响具体结果见图5，Ad-ING-4+ADM组、ADM组、Ad-GFP+ADM组、Ad-ING-4组的细胞凋亡率明显高于PBS组及Ad-GFP组（均P＜0.05）;且Ad-ING-4+ ADM组的细胞凋亡率要高于Ad-ING-4组及ADR组（均P＜0.05）;而PBS组和Ad-GFP组的细胞凋亡率无明显差异（P＞0.05）。

图4　Ad-ING-4感染后的MCF-7细胞的ING-4基因相关蛋白的表达

图5　Ad-ING-4对MCF-7细胞的凋亡率的影响

4　讨论

乳腺癌严重危害广大妇女健康。目前外科手术是乳腺癌的主要治疗手段，而术后化疗则是常规的后续治疗方案之一。然而，化疗效果并不是经常令人满意。传统化疗药物的药效往往因其严重的副作用而受到限制，而且肿瘤细胞也很容易产生耐药。因此，寻找一个能够改善化疗疗效的途径这一诉求显得迫切起来。

基因治疗在2009年被SCIENCE杂志誉为“十项重大科学发现之一”。肿瘤基因治疗是一种充满光明前景的新型肿瘤治疗方法。先前众多的相关研究表明ING-4在促进肿瘤细胞凋亡、细胞接触抑制、抑制肿瘤内血管生成等抑制肿瘤生长的活动中发挥着重要作用。在人神经胶质细胞瘤中，ING-4可通过调节p53的乙酰化状态增强p53的转录活性，可通过与NF-κB（nuclear factor-kappaB）的P65（RELA）亚基相互作用抑制其转录活性，抑制神经胶质瘤的生长和肿瘤新血管的生成［4，11］。在人前列腺癌中，ING-4能够抑制前列腺癌PC-3细胞增殖，同时上调p53、Bax和caspase-3的表达及下调bcl-2的表达，诱导PC-3细胞凋亡［12］。通过上述研究，我们可以得出一个初步结论:ING4可能与肿瘤细胞的生长与侵袭有着密切的联系。

在此项实验中，我们用100M浓度的AdING4病毒于体外感染MCF-7人乳腺癌细胞，发现感染实验组较之未感染对照组其细胞生长被明显地抑制。ING4基因的表达能促使MCF-7细胞的Bax基因表达明显上调，Bcl-2、Survivin基因表达明显下调，进而诱导细胞凋亡。与此同时，ING4与化疗药物（阿霉素）联合应用后产生了更为明显的协同效应，进一步促进了肿瘤细胞的凋亡。

综上所述，重组腺病毒介导的ING4能够有效地抑制MCF-7人乳腺癌细胞的增殖并促进其凋亡，至于其引起肿瘤细胞凋亡的更多分子机制尚有待于进一步研究。在此项实验中，我们发现ING4与化疗药物联合应用后对肿瘤细胞产生了明显的协同抑瘤效应，这给我们提供了一条肿瘤临床治疗的新思路，同时为进一步在临床上开展肿瘤基因治疗创造了条件。

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Enhanced chemotherapy sensitization effect of recombinant ING-4 adenovirus on MCF-7 breast cancercells

WU Yifu，DONG Xiaoqiang.

（Department of General Surgery，The First Affiliated of Soochow Universi-ty，Suzhou 215006，China）

WU Yifu，E-mail:821381555@qq.com

ObjectiveTo explore the growth-inhibitory effects on the MCF-7 human breast cancer cells of the adenovirus-mediated ING-4 gene.MethodsThe MCF-7 human breast cancer cells were infected with Ad-ING-4.Fluorescence microscope，RT-PCR and Western-Blot analysis were selected to detect the transcription of ING-4 gene.Cell growth inhibition and apoptosis were detected by CCK-8 assay and flow cytometry.In addition，RT-PCR was selected to detect the expression of Bax and Bcl-2.ResultsThe cell-growth of MCF-7 cells infected by Ad-ING-4 were obviously inhibited，and the infected cells had a higher apoptosis rate.Expression of ING-4 had relationships with the up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2and Survivin. ConclusionsAdING4 can inhibit the growth of MCF-7 cells and induce cell apoptosis，which may result in changing Bax and Bcl-2 expression.

ING-4 gene;adenovirus vector;MCF-7 human breast cancer cell;apoptosis

吴乙夫，男，硕士研究生，研究方向:乳腺疾病的基础研究，E-mail:821381555@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.01.011

1674-4136（2014）05-0040-04

2014-07-18］［本文编辑:刘嘉］