GPC3蛋白在肝细胞肝癌及肝内胆管细胞癌中的表达及临床意义

辛海荣，栗一帆，马晋峰，高泽峰

GPC3蛋白在肝细胞肝癌及肝内胆管细胞癌中的表达及临床意义

辛海荣，栗一帆，马晋峰，高泽峰

目的探讨GPC3蛋白在肝细胞肝癌、肝内胆管细胞癌及结节性肝硬化组织中的表达差异及临床意义。方法对50例原发性肝细胞肝癌、20例肝内胆管细胞癌及22例结节性肝硬化组织采用免疫组织化学法进行GPC3蛋白表达情况检测，比较分析其在三者中的表达差异。结果GPC3蛋白特异性表达于肝细胞肝癌，与其在肝内胆管细胞癌及结节样肝硬化组织中的表达相比，差异有统计学意义（均P＜0.05）。GPC3蛋白的在肝细胞肝癌中表达与患者的性别、年龄、肝功能分级、是否合并肝硬化、肿瘤直径、肿瘤个数、血管侵犯、TNM分期、HBsAg阳性等方面的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论GPC3高表达于肝细胞肝癌组织中，可能参与肝癌的发生发展。

肝细胞肝癌;肝内胆管细胞癌;结节性肝硬化;GPC3蛋白

磷脂酞肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是1996年Pilia等在研究过度生长综合症时发现的蛋白聚糖家族成员，是一种膜性硫酸乙酞肝素蛋白多糖，通过磷脂酞肌醇锚定在细胞膜上，能够调节不同的生长调节因子，进而在细胞的生长发育和恶变过程中起到关键作用。GPC3在人体胚胎、胎盘等组织中高表达，但在正常成人肝脏中无表达。最近文献相继报道了GPC3在HCC组织中高表达，阳性表达率70%～90%，提示GPC3对肝癌诊断有显著的灵敏性和特异性，可能成为新的标志物。

1　资料和方法

1.1标本来源及处理收集2004年5月至2008年1月我院经手术切除的50例原发性肝细胞肝癌、20例肝内胆管细胞癌及22例结节性肝硬化组织标本，参照美国肝病学会-巴塞罗那（AASLDBCLC）分期标准和治疗策略进行临床和病理诊断，50例原发性肝细胞肝癌，按照BCLC分期分为:极早期5例，早期12例，中期18例，进展期15例;20例肝内胆管细胞癌，亦按BCLC分期分为:极早期1例，早期3例，中期8例，进展期8例。以上病例血清HIV、梅毒等病毒标志物均为阴性，所有标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。所有标本取材均通过我院伦理委员会审核，家属知情同意并签字。标本保存于液氮罐中进行储存。

1.2试剂与仪器SP法免疫组化染色试剂盒（购于美国ZYMED公司，由国内北京中杉金桥生物技术有限公司代理），鼠抗人Glypican-3单克隆抗体（工作浓度1∶100，购自北京中杉金桥生物有限公司）。仪器包括:LEICA RM2135切片机（上海莱卡仪器有限公司），光学显微镜（日本Olympus公司），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.3方法免疫组化二步法:免疫组化SP法参照试剂盒说明进行（4 μm石蜡切片脱蜡至水。高压热抗原修复，PBS冲洗，每张切片滴加一滴过氧化物酶阻断剂，室温10 min，阻断内源性过氧化物酶。后经非免疫动物血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的第二抗体和辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温下各孵育10 min）。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。阳性标准的判断:随机取5个视野，每视野计数100个癌细胞为基数，按阳性细胞所占比例的平均数为评定阳性的依据，分为细胞无染色或阳性细胞＜5%为阴性（-），阳性细胞占5%～25%为弱阳性（+），阳性细胞占26%～50%为中阳性（++），阳性细胞＞50%为强阳性（+++），每批染色的阳性对照片应显示阳性，阴性对照片应显示为阴性，否则整批片重染。

1.4统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理，比较表达是否具有统计学意义。率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1GPC3在肝细胞肝癌、肝内胆管细胞癌及结节性肝硬化组织中的表达GPC3蛋白主要表达在肝细胞癌细胞的细胞质及细胞膜中（图1、2），GPC3在肝细胞肝癌组织中的阳性表达率为84.0%，其中强阳性26例，中阳性10例，弱阳性6例。GPC3主要表达在肝内胆管细胞癌的细胞质和细胞膜中（图3），GPC3在肝内胆管细胞癌中表达阳性率为10.0%，均为弱阳性。与在肝细胞肝癌中的阳性表达相比，两者差异有统计学意义（χ2=4.07，P＜0.05）。22例结节性肝硬化标本中，GPC3蛋白均为阴性。

2.2GPC3蛋白表达与肝细胞肝癌患者临床病理参数的关系具体数据见表1，结果表明，GPC3蛋白的在肝细胞肝癌中表达与患者性别、年龄、肝功能分级、是否合并肝硬化、肿瘤直径、肿瘤个数、血管侵犯、TNM分期、HBsAg阳性等方面的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1　GPC3蛋白表达与肝细胞肝癌患者临床病理参数的关系

3　讨论

GPC3蛋白是位于细胞膜表面的一种多糖蛋白，为IGF2等细胞因子的共同受体，其由核心蛋白和糖胺聚糖侧链构成，通过与细胞外基质、生长因子和蛋白酶等的相互作用传递信号，在细胞的生长、发育、分化和迁移中发挥重要功能［1］。近年来GPC3作为一种新的肝细胞癌标记物逐渐引起国内外学者关注。GPC3能通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上，并通过结合细胞外基质、生长因子和蛋白酶等参与调节肿瘤的细胞增殖、分化、黏附和转移等，与肝细胞癌的发生和发展有密切关系［2-3］。1997年Hsu等［4］首次报道了GPC3 mRNA在肝癌组织中高表达。随后越来越多的研究者证实，GPC3在肝癌中有特异性高表达，而在癌旁组织、肝硬化、肝炎组织、成人正常肝组织低表达或不表达，因而被认为其是原发性肝癌的一个新的肿瘤标志物。

GPC3成为诊断原发性肝癌，尤其是对早期肝癌的诊断特异性高正在被越来越多的学者所共识，并且对鉴别肝脏良性病变有着重要意义。Wang等［6］将手术切除的肝脏标本进行GPC3单克隆抗体免疫组化染色，其中包括111例原发性肝癌，48例肝细胞腺瘤，30例局灶性结节性增生，32例结节性肝硬化患者。结果显示111例原发性肝癌中有84例GPC3阳性染色，84例中有61例表现为弥漫性的免疫反应。肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生、结节性肝硬化显示没有检测到GPC3阳性染色。原发性肝癌中GPC3的表达与肿瘤的大小、分化、阶段肝硬化背景存在或不存在、相关病因无明显关联。叶玉清等［7］通过对肝细胞癌357例、胆管癌26例、肝细胞癌癌旁肝组织包括肝硬化171例、血管瘤旁肝组织93例、肝转移癌84例，采用免疫组织化学检测GPC3蛋白表达，结果显示72.0%的肝细胞癌GPC3呈阳性反应，其余374例非肝细胞癌病例均为阴性，包括胆管癌、肝转移癌、肝细胞癌癌旁肝组织（包括肝硬化和血管瘤旁肝组织）。GPC3阳性率在不同的肝细胞癌组织学分级的差异有统计学意义（P＜0.01）。Honsová等［8］通过对138例肝活检标本GPC3表达研究，包括86例肝癌、肝10例细胞腺瘤、12例局灶性结节性增生，25例无肿瘤的肝硬化、5例神经内分泌癌肝转移患者。结果显示，93%肝癌染色呈阳性，GPC3的表达与肝癌的分期、大小无明显关联，所有良性结节性病变、肝硬化非肿瘤病变GPC3的表达阴性。Wang等［9］通过54例原发性肝癌及其癌旁肝组织（21例肝硬化发展的肝癌和33例正常肝发展的肝癌）和94例肝硬化肿瘤结节进行GPC3免疫组化，21例肝硬化发展的肝癌中19例GPC3阳性染色，33例正常肝发展的肝癌中18例GPC3阳性染色，1例非肿瘤癌旁组织GPC3阳性染色，94例肝硬化肿瘤结节中，48%重度异型增生或早期原发性肝癌GPC3阳性染色，3%良性或低度不典型增生的肿瘤结节GPC3阳性染色，结果表明，GPC3是一种有效的肝癌诊断指标，潜在有用的肝细胞腺瘤和分化以及肝癌的鉴别诊断，GPC3可能被视为肝癌发生的早期标志物，能够识别恶性潜能的某些肝硬化结节。

最近研究表明，GPC3在原发性肝癌中表达成为影响肝癌患者预后和复发的潜在指标。Ning等［10］通过对61例原发性肝癌患者的免疫组化分析决定GPC3的表达及其与临床病理因素的关系，通过比较GPC3表达高低预测肝癌患者的生存时间。高GPC3的表达在肝癌患者手术后转移/复发的风险增加至3.214（相比低GPC3表达的HCC患者）。生存分析表明，肝癌患者高表达GPC3比肝癌患者低表达GPC3生存时间缩短（P=0.003）。此外，多变量分析表明GPC3表达对原发性肝癌患者是一个显着、独立的预后指标（P=0.030）。Shirakawa等［11］通过对107例原发性肝癌组织标本分析，高分化好肝癌组织中比在中、低分化肝癌组织GPC3的表达降低，差异在统计学上意义。本研究也表明GPC3表达与原发性肝癌患者的预后不良相关。

胆管细胞癌是原发性肝癌的病理分型中较少见的一种，由于其症状隐匿、不典型，早期临床表现多不明显，故确诊时往往已经处于晚期。目前无特异性肿瘤标志物对胆管细胞癌早期诊断起到提示作用。Man等［12］通过GPC3的表达在肝内胆管细胞癌、胆囊癌、肝癌进行定量逆转录聚合酶链反应，检测GPC3的表达水平。结果显示肝癌组织中GPC3的表达升高超过2倍高于癌旁组织，而21例胆管细胞癌患者，只有4例GPC3在肿瘤组织中的表达上调2倍高于癌旁组织。结果证明，GPC3可以作为一种生物标志物的鉴别诊断肝细胞肝癌和肝内胆管癌。Lagana等［13］通过41例胆管细胞癌、24例转移性肝肿瘤组织进行免疫组化染色，无1例胆管细胞癌GPC3表达阳性，8%转移性肝肿瘤组织GPC3表达阳性。

综上所述，GPC-3及其mRNA在HCC组织中的表达增加，特异性较高，具有早期诊断价值。采用灵敏度高，特异性强的分子生物学技术去探测患者肝癌发生相关基因标志，并结合癌细胞表达的特异性蛋白检测，可早期诊断肝癌、监测肝癌发生、术后复发及远处转移。单克隆抗体能够特异性的识别GPC-3，证实来其可能是一种有希望的早期诊断肝癌的癌胚胎性蛋白，同样也可能基于单克隆抗体基础上开辟新的靶向治疗。

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Expression of GPC3 protein in bile duct in hepatocellular carcinoma and hepatic cell carcinoma

XINHairong，LI Yifan，MA Jinfeng，et al.

（Department of General Sugery，Shanxi Province Tumour Hospital，030013 Taiyuan，China）

XIN Hairong，E-mail:xhrzyy@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of GPC3 in bile duct in hepatocellular carcinoma，intrahepatic cholangiocarcinoma，and to compare GPC3 expression difference of bile duct in hepatocellular carcinoma，hepatic cell carcinoma，nodular cirrhosis.Methods50 cases of primary hepatocellular carcinoma，20 cases of intrahepatic cholangiocarcinoma，22 cases of nodular cirrhosis，immunohistochemistry method were used to detect GPC3 expression，difference of bile duct in hepatocellular carcinoma，intrahepatic cholangiocarcinoma，nodular cirrhosis of the liver in GPC3.Resultsthe GPC3 specific expression in hepatocellular carcinoma，the expression of sensitivity and specificity were 84%，97.7%，compared with the expression of GPC3 in intrahepatic cholangiocarcinoma，nodular cirrhosis，the difference was statistically significant（P＜0.05）. GPC3 protein expression in hepatocellular carcinoma associated with gender，age，liver function classification，cirrhosis，tumor size，tumor number，vascular invasion，TNM staging，HBsAg positive aspects of the difference was not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionsThe high expression of GPC3 in hepatocellular carcinoma tissues，there may be involved in the development of hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;intrahepatic cholangiocarcinoma;cirrhosis;GPC3 protein

广东省医学科研基金（项目编号:B2007134）

作者单位:030013山西太原，山西省肿瘤医院普外二科

辛海荣，男，副主任医师，医学硕士，擅长肝、胆、胃、肠、胰腺及腹膜后肿瘤等疾病的诊治，E-mail:xhrzyy@126.com通讯作者:杨熙鸿，男，广东人，主任医师，研究方向:头颈部肿瘤的综合治疗，E-mail:yxihong@21cn.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.01.010

1674-4136（2014）06-0036-04

2014-05-05］［本文编辑:刘嘉］