中西药联合逆转人胃癌细胞多药耐药机制

段春兰　张爱民　付桂珍

（1 包头医学院第一附属医院消化科，内蒙古 包头 014010；2 包头医学院第一附属医院消化科，内蒙古 包头 014010；3 乌兰察布市化德县医院，内蒙古 乌兰察布 013350）

中西药联合逆转人胃癌细胞多药耐药机制

段春兰1张爱民2付桂珍3

（1 包头医学院第一附属医院消化科，内蒙古 包头 014010；2 包头医学院第一附属医院消化科，内蒙古 包头 014010；3 乌兰察布市化德县医院，内蒙古 乌兰察布 013350）

目的 探讨氟尿嘧啶（5-FU）、斑贞1号和川芎嗪（TMP）联合逆转人胃癌细胞与乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）表达的相关性。方法 通过半定量RT-PCR比较人胃癌细胞在单纯5-FU和5-FU联合TMP和斑贞1号处理组BCRPmRNA的表达情况。结果 5-FU组与对照组相比，BCRP表达P＞0.05，无差异，而5-FU联合TMP及斑贞1号处理组BCRP表达量明显降低P＜0.05。结论 5-FU、斑贞1号和TMP联合逆转人胃癌细胞SGC-7901/ADR耐药性可能与BCRP相关。

胃癌；多药耐药；斑贞1号；TMP；5-FU；BCRP

胃癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的治疗以手术和化疗为主，由于目前没有开展胃癌筛查，患者确诊时已处于晚期，失去手术机会，故化疗显得尤为重要，但目前化疗结果差，造成这一结果主要原因是胃癌多药耐药性（MDR），近几年发现乳腺癌耐药蛋白（BCRP）在胃癌多药耐药性方面起着重要作用，侯培珍等研究［1］已证实斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用［1］。因此我们在此基础上，旨在检测不同药物组BCRPmRNA的表达量，进一步探讨了中西药对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的逆转机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂：斑贞1号按比例加斑蝥、女贞子、露蜂房、山茱萸共42.06 g，加入2000mL三蒸水，慢火加热，至200mL时过滤，浓度为0.2103 g/mL的斑贞1号溶液。TMP、5-FU（南通精华制药有限公司），新生小牛血清（赛默飞世尔生物化学制造）、二甲基亚砜（大连宝生物公司）、胰蛋白酶（北京经科宏达公司），RT-PCR试剂盒及Trizol（TakaRa公司），RPMI1640（美国GIBCO公司产品），PCR引物序列（上海生工生物工程有限公司），细胞系：人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞（西京医院消化研究内科实验室所提供）。

1.2主要仪器和设备：电泳仪（DF-D，北京）、PCR扩增仪（美国AB公司）、紫外分光度计（SFZ0806011349，上海）。

1.3实验方法

1.3.1细胞处理：常规方法培养人为胃癌细胞SGC-7901/ADR，取对数生长期细胞，胰酶消化后接种于6孔板上，每孔2mL，然后培养24 h，每孔分别加入新的培养液；5-FU稀释液；斑贞1号稀释液；5-FU+斑贞1号；5-FU+TMP+斑贞1号（根据MTT试验结果选药物浓度，选IC50值）。然后继续培养48 h，用PBS缓冲液冲洗1次，提取总mRNA。

1.3.2RT-PCR检测：采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，以mRNA为模板经逆转录合成cDNA，。

PCR每个样品反应体系25μL，即10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5μL，Takara Taq 1μL，dNTP Mixture 2μL，ddH2O 13.5μL，目的基因上、下游引物各0.5μL，（引物序列见表1）灭菌蒸馏水13.5μL，各样品cDNA5μL。

BCRP扩增条件：预变性、变性、退火、分别是93 ℃ 3min→93 ℃30s→54 ℃ 30s→72 ℃30s g共40个循环，最后延伸72 ℃ 10min；扩增结束后，PCR扩增产物取10μL，100V条件下在2%琼脂糖凝胶上进行电泳60min。将电泳凝胶于紫外线下观察并用凝胶成象系统照相分析，得到各电泳带平均吸光度值。

1.3.3统计学方法：应用SPSS 10.0统计软件作处理，采用方差分析及LSD-t检验，P＜0.05表示差别有统计学意义。计量数据描述用均数±标准差表示。

2　结 果

2.1SGC7901/ADR细胞经不同药物处理后BCRP mRNA的表达：5-FU组BCRP mRNA表达量为（2.11±0.24），对照组为（2.20±0.26），二者比较P=0.23，无统计学意义，其他药物组与对照组及组间比较P＜0.05，有统计学意义斑贞1号+TMP+FU组表达量最少。

2.2所有RT-PCR扩增产物均产生基因扩增带，证实逆转录完整性和PCR反应是成功的。BCRP和-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于346 bp和528 bp，和预期长度吻合，说明均为特异性扩增片段（图1）。

图1　细胞经不同药物处理后BCRP表达的凝胶图像

表1　BCRP、-action基因上、下游引物。

3　讨 论

在胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，它的发病率及病死率居恶性肿瘤第二位［2］，化疗是综合治疗胃癌的重要方法之一，目前大多数研究认为胃癌的MDR是化疗缓解率低的主要原因［3-4］，目前认为多种因素参与肿瘤的多药耐药，Ningetal在研究胃癌干细胞时发现，BCRP在胃癌MDR中起重要作用［5］，BCRP是Doyle［6］首先发现于乳腺细胞中，故被称为乳腺癌耐药蛋白，它是第一个位于细胞膜上的新ABC半转运蛋白，相对分子质量大小为2.4kb，基因定位于4q22.23，通过药物溢出泵的机制导致耐药，与多种瘤细胞泵的MRD相关。它与p-gp、MRP一样，具有把化疗药物米托蒽醌、阿霉素等从肿瘤细胞里“泵出”的作用［7］。

中药及其复方制剂由于多种活性成分并存，能通过多种途径、多个靶点在肿瘤的治疗中发挥作用［8］。本课题斑贞1号合剂主要有（露蜂房、山茱萸、女贞子、斑蝥素），主药为斑蝥素和露蜂房，辅佐药为山茱萸和女贞子，斑蝥素的抗肿瘤机制主要是抑制细胞的蛋白质的合成，降低癌毒激素水平及影响癌细胞的核酸代谢，女贞子具有扶正祛邪，抑制幽门螺杆菌的作用及抑制嘌呤异常代谢并对染色体损伤和突变具保护作用，TMP是一种钙离子通道阻滞剂，通过多种途径逆转肿瘤多药耐药。杨叶，侯培珍等［9］已证实川芎嗪能显著增加肿瘤细胞对5-FU的敏感性；本文显示，斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ ADR细胞有较强的逆转作用，本研究表明斑贞1号+5-FU+TMP组BCRP mRNA表达量低于其他用药组，组间比P＜0.05，有显著性差异，证明三种药物联合可抑制耐药细胞BCRP mRNA的高表达，逆转了BCRP基因介导的多药耐药性，增强了治疗效果。

［1］ 侯培珍，张娟，赵永峰.中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究［J］.第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.

［2］ 韩全利，张龙方，李静，等.Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的克隆及表达［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18（12）：41-42.

［3］ Hao SL，Liu LK，Li YF.Miultidrug resistance mechanisms and reversal agents in gastric carcinoma cells ［J］.Cancer Res Clin，2007，19（1）：68-72.

［4］ 檀碧波.胃癌多药耐药异质性的临床与基础研究［D］.石家庄：河北医科大学，2010.

［5］ 王新；胃癌SGC7901细胞多药耐药相关新蛋白和基因的筛选及鉴定［D］.西安：第四军医大学；2001.

［6］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance tansproter from human MCF-7 breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15665-15670.

［7］ 张燕，金先庆，赵珍珍，等.5种耐药基因在成人常见恶性肿瘤中的表达特点［J］.重庆医科大学学报，2007，32（10）：1023.

［8］ 盛桂琴.中医药逆转胃癌多药耐药进展［J］.医学综述，2011，17（5）：776-779.

［9］ 杨叶，侯培珍，张娟.川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ ADR的杀伤作用［J］.肿瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.

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1671-8194（2015）10-0074-02