麝香保心丸对实验大鼠血管钙化的作用

张旭升 朱平先 黄战军 蔡博治 张昕 张勇刚

摘要：目的在大鼠血管鈣化模型上，探讨麝香保心丸对血管钙化的影响及其可能作用机制。方法实验动物随机分正常组、钙化组及钙化+麝香保心丸组，每组6只。钙化组采用维生素D3（3×105 U/kg 1次，肌肉注射）和尼古丁（25 mg/kg溶于花生油中，早、晚各灌胃1次）诱导大鼠血管钙化模型，钙化+麝香保心丸组于造模后第2天开始，每天麝香保心丸灌胃[14.0 mg/（kg·d）]，用Von Kossa染色检测血管钙化程度，用钙离子测试盒、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定大鼠主动脉钙含量和ALP活性，用放射免疫法检测大鼠血浆单核细胞趋化蛋白1（MCP1）含量，用免疫组织化学法检测血管组织MCP1受体表达。结果维生素D3和尼古丁能够诱导典型大鼠血管钙化模型，Von Kossa染色可见血管钙化模型大鼠主动脉有大量黑色颗粒沉淀，钙化组血管钙含量、ALP活性高于正常组（P<0.01），同时，血浆MCP浓度、血管组织MCP1及其受体表达明显上调（P<0.01）;用麝香保心丸干预后，血管钙化程度减轻（P<0.01）。血浆MCP1及其受体的表达下调，差异有统计学意义。结论麝香保心丸可抑制血管钙化，并且提示可能通过下调MCP1表达和ALP活性抑制血管钙化的发生和发展过程。

关键词：麝香保心丸;血管钙化; 单核细胞趋化蛋白1;大鼠

中图分类号：R288.5文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.019

文章编号：16721349（2015）01005203

Effect of Shexiang Baoxin Pill on Vascular Calcification in Model Rats

Zhang Xusheng，Zhu Pingxian， Huang Zhanjun，Cai Bozhi， Zhang Xin， Zhang Yonggang

Longgang District Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518172，Guangdong，China

Corresponding Author：Zhu Pingxian

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanism of Shexiang Baoxin Pill（SBP） in aorta of vascular calcification model rats.MethodsSevenweekold male SpragueDawley （SD） rats were randomly divided into normal group， calcification group and calcification plus SBP group （all n=6）.On the first day in calcification and calcification plus SBP group， vascular calcification was induced by a single dose intramuscular injection of vitamin D3 （300 000 U/kg） in the morning plus two doses of nicotine （25 mg/kg dissolved in peanut oil ） gavage in the morning and in evening.The next day after calcification induction， rats in SBP group were gavaged with SBP[14 mg/（kg·d）] for four weeks.Vascular calcification was confirmed by Von Kossa staining.Calcium content and alkaline phosphatases （ALP） activity were detected by calcium assay kit and ALP detection kit respectively.The contents of plasma monocyte chemotactic protein1 （MCP1）  were determined by radioimmunoassay， and the expressions of corresponding receptors were determined by immunohistochemistry. ResultsVon Kossa staining showed that there were mass black granules deposited in aortic wall of the vascular calcified rats.Calcium content and ALP activity in calcified group were increased significantly than those in the control group （P<0.01）.Meanwhile， MCP1 contents in plasma and corresponding receptor level in calcified group were upregulated significantly compared with those in the control group（P<0.01）.In addition， SBP diet could reduce the degree of vascular calcium contents， ALP activity and MCP1 content.ConclusionSBP significantly protects the aorta against calcification partly through reducing MCP1 content and ALP activity.

Key words：Shexiang Baoxin pill;vascular calcification;monocyte chemotactic protein1;rat

血管钙化是目前临床上常见的病理表现，普遍存在于高血压、动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾功能不全等疾病，亦存在于老年人生理性钙化中，是导致心脑血管急性事件的重要危险因子。国内外研究表明，血管钙化与生理性骨质形成类似，是主动的、可调节的过程[1]。目前证实许多活性因子如心血管组织分泌的活性因子（内皮素、尾加压素Ⅱ等）[2，3]和醛固酮[4]等都参与了血管钙化的调节过程。本课题组近期发现[5]，炎症因子参与血管钙化的发生与发展，然而，血管钙化的机制非常复杂，具体机制尚未完全阐明，临床上寻找防治血管钙化的药物，是当前研究领域的重点。研究表明，麝香保心丸具有抗炎、保护内皮细胞功能等作用，在动脉粥样硬化等疾病的治疗发挥了很大的作用，但在血管钙化方面的作用尚不清楚。本研究在维生素D3与尼古丁诱导的大鼠血管钙化模型上，用麝香保心丸干预，观察血管钙化指标和单核细胞趋化蛋白1

（MCP1）的变化，探讨麝香保心丸在血管钙化中的作用和可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及药品无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[动物许可证号：SCXK（京）20120001]，约7周龄，150 g～180 g。维生素D3购自Sigma公司，尼古丁购自Merck公司，纯度>95%;碱性磷酸酶（ ALP）试剂盒、钙离子测试盒购自南京建成生物工程研究所;单核细胞趋化蛋白1试剂盒购自北京华英生物研究所，MCP1受体一抗购自北京博奥森，二抗即用型二步法（非生物素）检测，试剂盒购自北京中杉金桥，DAB显色试剂盒购自武汉博士德;麝香保心丸购自上海和黄药业有限公司，生产批号：12050401。其余为进口或国产分析纯试剂。

1.2钙化动物模型制备参照文献制备血管钙化动物模型[3]。雄性SD大鼠随机分3组，每组6只。 正常对照组：大鼠第1天予等量生理盐水肌注和单纯花生油灌胃;钙化组：第1天08：00予维生素D3肌肉注射（3×105 U/kg体重），尼古丁灌胃（25 mg/kg，溶于花生油），18：00尼古丁重复灌胃一次。钙化+麝香保心丸组：模型制作同钙化组，第二天开始予麝香保心丸胃灌[14 mg/（kg·d）]，1次/天。3组动物常规饲养，4周后称重，3%水合氯醛麻醉，心脏取血，置入含有EDTA的试管中，4 ℃离心分离血浆，-80 ℃保存。摘取主动脉，用冰生理盐水冲洗后，部分石蜡包埋用于染色， -80℃储存待测。

1.3Von Kossa染色取大鼠胸主动脉段，石蜡包埋，制作4 μm厚切片，常规脱蜡、脱水。浸入1%硝酸银溶液，在紫外线下照射30 min后，将切片置于5%硫代硫酸钠溶液中1 min，0.25%碱性品红返染。经脱水、透明、封片，在光镜下观察。

1.4血管组织ALP活性及钙含量测定取腹主动脉组织约40 mg，送南京建成生物工程研究所检测，采用磷酸苯二钠法测定ALP活性及甲基百里香酚蓝比色法测定钙含量。

1.5血浆MCP1含量测定取血浆约200 μL，置于0.5 mL EP管，送北京华英生物研究所检测（放射免疫法）。

1.6免疫组织化学法检测主动脉组织中MCP1受体的表达采用4%多聚甲醛固定胸主动脉，常规脱蜡至水、抗原修复、封闭非特异性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、脱水、透明、中性树胶封片。

1.7统计学处理统计软件采用Graph Pad Prism 4进行。计量资料以均数±标准差

（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠主动脉钙化情况维生素D3和尼古丁诱导后，用Von Kossa染色可观察到主动脉中膜弹性纤维间可见大量黑色颗粒沉积，表明大量钙盐沉积、典型血管钙化形成，用麝香保心丸干预后，血管钙化程度有所减轻。

2.2大鼠主动脉组织钙含量、碱性磷酸酶活性的变化钙化组主动脉组织钙含量及碱性磷酸酶活性明显高于正常组，用麝香保心丸干预后，主动脉钙含量和碱性磷酸酶活性有所下降。详见表1。

2.3大鼠血浆、主动脉组织MCP1受体的变化与正常组相比，两组血浆MCP1及血管组织中MCP1受体的表达明显上调，钙化组最为明显。详见表2。

3讨论

血管钙化是一个主动演变的过程，在某些病理情况下，如在氧化应激、高钙磷血症、高血糖及高脂血症等的刺激下，其中平滑肌细胞、内皮细胞、外周细胞及间充质祖细胞等向成骨样表型细胞的转化是血管钙化发生发展的重要核心。许多研究发现，维持血管稳态的旁/自分泌因子参与血管钙化的发生发展，如内皮素1、血管紧张素Ⅱ[6]等可促进血管钙化。本课题组前期研究亦发现，部分炎性因子（如CRP、IL6等）、血管活性肽（如尾加压素Ⅱ等）及醛固酮等与血管钙化密切相关。血管钙化普遍存在于动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变及慢性肾病等疾病中，是心脑血管疾病高发病率和死亡率的重要因素之一，因此，临床上防治血管钙化的发生与发展具有重要的意义。

麝香保心丸源于宋代经典名方《太平惠民和剂局方》中的苏合香丸，是芳香温通类的代表药物。最近研究发现，麝香保心丸具有保护血管内皮[7]、稳定逆转斑块[8]、抗炎[9]、促进治疗性血管新生及预防PCI后再狭窄[10，11]等作用，但在血管钙化防治方面，尚无相关研究。为此，本研究在维生素D3和尼古丁诱导大鼠血管钙化模型上，用麝香保心丸干预，观察血管钙化程度的变化，并初步从炎症方面探讨相关机制。

本实验结果发现，利用维生素D3和尼古丁合用可诱导大鼠动脉组织钙含量增加，主动脉中膜大量钙沉积及钙结节形成，形成典型血管钙化，血管钙含量和ALP活性亦同步上调，MCP1表达均高于正常组，与文献报道一致[5]。许多研究表明，炎症因子参与许多心血管疾病的发生与发展，包括动脉粥样硬化等，如MCP1可使单核或巨噬细胞等炎症细胞发生迁移并聚集，并激活炎症细胞，产生白介素6、肿瘤坏死因子α等炎症反应介质，从而构成血管炎症发生发展的重要机制。本课题组亦发现炎症因子与血管钙化密切相关，钙化组织炎症细胞的聚集和炎症因子表达的增加与血管钙化密切相关。给予麝香保心丸干预后，血管钙化的程度减轻，提示麝香保心丸可抑制血管钙化的进程。用麝香保心丸干预后，ALP活性和MCP1表達亦下调，提示麝香保心丸抑制血管钙化的机制可能是通过下调MCP1的表达和ALP活性实现。由于植物提取物成分和有效成分作用靶点的复杂性，中药成分对血管钙化的药理学作用尚需进一步研究。

本实验发现，麝香保心丸可抑制血管钙化，下调ALP活性及MCP1表达，其抑制血管钙化的机制可能与通过下调ALP活性及MCP1表达等有关，这将为血管钙化的机制研究及防治提供新的思路和作用靶点。

参考文献：

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[2]Wu SY，Zhang BH，Tang CS，et al.Endothelin1 is a potent regulator in vivo in vascular calcification and in vitro in calcification of vascular smooth muscle cells [J].Peptides，2003，24（8）：11491156.

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[4]黄战军，张旭升，周小欧，等.大鼠血管钙化模型主动脉醛固酮及其受体的表达[J].中华高血压杂志，2012，20（11）：10351038.

[5]张旭升，周小欧，黄战军，等.大鼠血管钙化模型炎症因子及其受体的表达[J].岭南心血管病杂志，2013，19（3）：341345.

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[8]林惠珍，贾连旺.麝香保心丸对颈动脉粥样硬化的作用[J].浙江中西医结合杂志，2007，17（8）：473475.

[9]Tian D，Ling S，Chen G et al.Hypertensive nephropathy treatment by heartprotecting musk pill：A study of antiinflammatory therapy for target organ damage of hypertension[J].Int J Gen Med，2011，15（4）：131139.

[10]叶子，李勇，施海明，等.麝香保心丸的小鼠含药血清促鸡胚尿囊膜血管生长的研究[J].上海医学，2006，29（5）：300302.

[11]车贤达，钱琳艳，高瑞兰.麝香保心丸预防冠心病PCI术后再狭窄的临床疗效观察[J].中华中医药学刊，2008，26（4）：765766.

（收稿日期：20140227）

（本文編辑王雅洁）