冠心病慢性心力衰竭患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的研究

王欢 胡元会 魏艺 贾岱琳 杜柏

摘要：目的测定冠心病慢性心力衰竭患者的免疫功能及血浆N端脑钠肽前体（NTproBNP）水平，评价冠心病慢性心力衰竭的免疫激活状态。方法收集2013年8月—2014年2月，中国中医科学院广安门医院心内科的住院患者125例，其中慢性心力衰竭患者93例，非心力衰竭患者32例。采用化学发光免疫方法测定血浆NTproBNP水平，流式细胞技术测定外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。结果冠心病慢性心力衰竭患者血浆NTproBNP高于冠心病非心衰组，而外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例低于非心力衰竭组。结论冠心病慢性心力衰竭患者存在免疫激活状态，且血浆NTproBNP水平随NYHA心功能分级增加而升高。

关键词：冠心病;慢性心力衰竭;N端脑钠肽前体;CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞

中图分类号：R541R256.2文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.012

文章编号：16721349（2015）01003304

Study of Peripheral Blood CD4+ CD25+Foxp3+Treg Cell in Patients with Coronary Heart Disease and Chronic Heart Failure

Wang Huan，Hu Yuanhui，Wei Yi，Jia Dailin，Du Bai

Guanganmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China

Corresponding Author：Hu Yuanhui

Abstract：ObjectiveTo observe the immune function and plasma Nterminal proBtype natriuretic peptide （NTproBNP） levels，and to evaluate the state of immune activation in in patients with coronary heart disease（CHD） and chronic heart failure（CHF）.MethodsFrom August 2013 to February 2014 in department of cardiology of Guanganmen hospital of traditional Chinese academy， a total of 125 inpatients， of whom 93 patients with CHF，32 patients with nonheart failure were chosen.The level of plasma NTproBNP was determined by chemiluminescence immunoassay method.The peripheral blood CD4+ CD25+Foxp3+Treg cell ratio was measured by flow cytometry.ResultsThe levels of plasma NTproBNP in patients with CHF were higher than that in patients with nonheart failure.The peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in patients with CHF was lower than that in patients with nonheart failure.ConclusionThere is the presence of immune activation state in patients with CHF and the levels of plasma NTproBNP increase with increasing New York Heart Association （NYHA） functional class.

Key words：coronary heart disease;chronic heart failure;Nterminal proBtype natriuretic peptide;CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells

心力衰竭是各種心脏疾病发展至终末阶段的一种综合征。心力衰竭的发病机制十分复杂，近年来的研究发现，在心力衰竭患者的外周血中存在大量活化的炎症因子且存在免疫激活[1]。本课题欲通过研究外周血调节性T细胞，以阐述慢性心力衰竭过程中的免疫激活状态。

1资料与方法

1.1研究资料

1.1.1研究对象收集2013年8月—2014年2月，中国中医科学院广安门医院心内科的住院患者125例，其中慢性心力衰竭患者（CHF组）93例，男性45例，女性48例，年龄（71.09±3.97）岁;纽约心脏病学会（NYHA）Ⅱ级25例（男性13例，女性12例），年龄（66.36±7.81）岁;Ⅲ级35例（男性15例，女性20例），年龄（72.03±2.13）岁;Ⅳ级33例（男性15例，女性18例），年龄（70.76±4.12）岁。非心力衰竭患者（非CHF组）32例，男性14例，女性18例，年龄（67.90±4.43）岁，NYHA心功能为Ⅰ级。

1.1.2诊断标准

1.1.2.1冠心病诊断参照1979年国际心脏病学会和协会及卫生组织临床命名标准化联合专题组颁布的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》[2，3]，并结合冠状动脉造影结果，采用标准Judkins法，以一支或以上冠状动脉直径狭窄≥50%判断为阳性者[4]，或既往有心肌梗死病史。

1.1.2.2慢性心力衰竭诊断采用Framingham心力衰竭诊断标准[5]，参考2009年美国心脏病学会（ACC）及美国心脏协会（AHA）关于《成人慢性收缩性心力衰竭治疗指南》[6]，参考彩色多普勒超声心动图，左室射血分数（LVEF）<50%[7]。

1.1.2.3心功能分级诊断参照1994年NYHA分级标准[8]。

1.1.3纳入标准

1.1.3.1冠心病慢性心力衰竭患者纳入标准符合冠心病并符合慢性心力衰竭诊断标准;年龄50岁～75岁;自愿参加试验并签署知情同意书。完全符合上述三项条件选择纳入。

1.1.3.2冠心病非心力衰竭患者纳入标准符合冠心病诊断标准，心功能Ⅰ级患者;年龄50岁～75岁;自愿参加试验并签署知情同意书。完全符合上述三项条件选择纳入。

1.1.4排除标准临床相关资料不完整;瓣膜性心脏病（风湿性心脏病，老年退行性心脏瓣膜病，肺心病者）;严重心律失常（频发室性早搏，Ⅱ度Ⅱ型房室传导阻滞，Ⅲ度房室传导阻滞）;近3个月内发生过不稳定心绞痛或急性心肌梗死;恶性肿瘤;自身免疫性疾病;严重肝肾功能不全者;合并重度高血压（收缩压≥160 mmHg和/或舒张压≥100 mmHg）;糖尿病及内分泌疾病;急性、慢性感染或发热;近3个月服用过影响免疫反应的中西药物;精神疾病或行为不能自负;妊娠或哺乳期者;不愿参加试验的患者。

1.1.5剔除标准无法判断疗效或资料不全影响疗效判断者;中途自动退出者。

1.2研究方法

1.2.1血液采集患者于入院后第2天，清晨空腹卧位状态下，禁食12 h后，采集静脉血4 mL置于肝素抗凝管内，同时采集静脉血2 mL置于EDTA试管内，肝素抗凝管及EDTA抗凝管内血液均于采血后30 min内进行样本处理。

1.2.2检测方法

1.2.2.1外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的检测取两支Falcon试管，分别标记对照管和测定管。在对照管中分别加入Mouse IgG 110  μL并轻轻混匀;在测定管中分别加入CD4 20 μL、CD25 5 μL并轻轻混匀。在对照管和试验管中各加入全血100 μL，轻轻混匀，室温暗处孵育30 min，使表面抗原与抗体结合。在对照管和試验管中各加入2 mL溶血素，室温避光孵育10 min后，离心2 000 r/min，5 min，弃上清;再各管中加入2 mLPBS，离心2 000 r/min，5 min，弃上清。对照管和试验管中各加入1 mL 1×Foxp3破膜/固定液，室温避光孵育60 min进行破膜后，离心2 000 r/min，5 min，弃上清。在对照管和试验管中各加入50 μL  1×破膜剂后，对照管中加入5 μL Rat IgG2ak Foxp3同型，试验管中加入5 μL Foxp3抗体，室温避光孵育30 min后，每管中加入2 mL破膜剂，离心2 000 r/min，5 min，弃上清。对照管和试验管中各加入500  μL×破膜剂，重悬，即刻上机检测，共检测CD4+细胞10 000个，CXPCytometer软件分析数据，获得待测标本的CD4+CD25+Foxp3+的荧光散点图，对其进行统计分析。

1.2.2.2血浆NTproBNP的检测调试PATHFAST化学发光免疫分析系统，输入编号信息。使用PATHFAST NTproBNP试剂管条，并按要求方向装好试剂条。在样本孔放入血浆样品100 μL。把试剂架放入试剂槽内。把样本头置入吸头槽。合上前盖，按下Start键。从样本信息界面读取检测结果。

1.2.3统计学处理数据统计采用盲法，由第三方人员统计，所有试验数据录入计算机，采用SPSS 20.0统计软件进行统计。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，分类变量以百分比表示。若数据满足正态性检验和满足方差齐性检验，使用t检验或单因素的方差分析;计数资料比较使用卡方检验;相关性分析使用Spearmen相关性检验。以P<0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1一般资料CHF 组与对照组，经独立样本t检验，在年龄、性别比例方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。NYHA不同心功能分级组间，经方差分析检验，在年龄、性别方面无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2血浆NTproBNP及 CD4+CD25+Foxp3+水平（见表1）

2.3NYHA不同心功能分级患者血浆NTproBNP水平（见表 2）

由NYHA心功能分级与血浆NTproBNP的相关性检验得，Spearman r=0.777，P<0.01，两者呈正相关，提示血浆NTproBNP水平随NYHA分级增高而升高。

2.4NYHA不同心功能分级患者外周血CD4+CD25+Foxp3+水平（见表3）

由NYHA心功能分级与血浆CD4+CD25+Foxp3+水平的相关性检验得，Spearman r=-0.127，P>0.05，尚不能提示血浆CD4+CD25+Foxp3+水平随NYHA分级增高而降低。

3讨论

B型脑钠肽是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。NTproBNP和BNP同属利钠肽家族，BNP基因经转录后生成含134个氨基酸的preproBNP，然后迅速裂解脱去含26个氨基酸的N端信号肽生成含108个氨基酸的proBNP，随后再在内切酶的作用下裂解为具有32个氨基酸的生物学活性的BNP和76个氨基酸的无生物学活性的NT proBNP[9]。而NTproBNP半衰期较长，在血液中水平较稳定。BNP是一种天然的神经激素， 其主要生物学活性包括舒张血管，促进尿钠排泄、利尿[10]。BNP可以作为诊断心力衰竭及判断预后的血浆标志物[11]。刘洪岩等[12]研究CHF患者血浆BNP水平与心功能的关系，选取90例CHF男性患者与90名健康男性作为研究对象，采用ELISA法测定血浆BNP水平，结果显示CHF患者的血浆BNP水平显著高于健康人，且BNP水平随心功能的恶化而显著升高。

调节性T细胞是一类细胞膜上高表达IL2受体链（CD25）的CD4+T细胞亚群（即CD4+CD25+Treg細胞），可通过分泌IL10和TGFβ等抑制性细胞因子，发挥免疫抑制功能，在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用[13]，临床研究显示[14]，心衰患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平降低，且与心衰的病因无关。

程翔等[15]采用流式细胞分析法比较42例CHF患者与16名健康人的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，结果显示CHF患者的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例显著低于健康人，且心功能Ⅲ级～Ⅳ级患者Treg细胞的比例明显低于Ⅱ级患者，从而得出CHF患者的调节性T细胞比例下降，且与心功能有关。姚红等[16]研究大鼠外周血T细胞亚群变化与β3AR自身抗体产生的关系，采用腹主动脉缩窄法制备大鼠心衰模型，结果显示β3AR自身抗体水平与CD4+T细胞含量呈正相关，而与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量呈负相关，认为在心衰发展过程中存在明显的T细胞亚群失衡，且伴随有β3AR自身抗体产生，Treg细胞可能对此抗体的产生有重要作用。

在本研究中，冠心病慢性心力衰竭患者血浆NTproBNP明显高于非心力衰竭患者，且与心功能分级呈正相关，提示慢性心力衰竭患者血浆NTproBNP水平可以作为CHF患者心功能的一个重要指标。同时，CHF患者与非CHF患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比较，随着NYHA心功能分级的增加而外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞低于非CHF患者，表明冠心病慢性心力衰竭患者体内存在免疫激活状态。

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（收稿日期：20140818）

（本文编辑王雅洁）