新生BALB/c小鼠口服灭活幽门螺杆菌对特异性抗体的影响作用

杨钰欣 江吉富

【摘要】目的：探索BALB/c小鼠新生期口服灭活幽门螺杆菌（H.pylori）后能否产生特异性sIgA与IgG。方法：将24只BALB/c小鼠分为三组进行实验。第Ⅰ组为PBS对照组，第II组为灭活H.pylori组，第Ⅲ组为灭活H.pylori加大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）组。用相应抗原成分对各组出生24小时以内的新生BALB/c小鼠进行灌胃免疫，末次免疫两周后，检测小鼠血清抗幽门螺杆菌IgG及胃粘膜抗幽门螺杆菌sIgA。结果：Ⅰ、II、Ⅲ组血清特异性IgG浓度分别为2.1±0.67、8.84±1.07、37.50±4.87ng/ml；胃粘膜特异性sIgA浓度分别为1.60±0.49、1.96±0.47、6.56±1.24ng/ml。Ⅲ组血清IgG浓度与胃粘膜sIgA浓度分别与Ⅰ、II进行比较，结果显示差异有统计学意义（P<0.05）；II组血清IgG浓度与其余两组进行比较分析，结果显示差异有统计学意义（P<0.05），而该组sIgA浓度与其余两组的比较显示差异无统计学意义（P>0.05）。结论：在BALB/c小鼠新生期给予灭活幽门螺杆菌与LTB灌胃免疫后能使机体胃粘膜特异性sIgA与血清IgG显著增高。

【关键词】灭活幽门螺杆菌；LTB；新生BALB/c小鼠。

【中图分类号】R341【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0088-01

前言

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是人类最常见的病原菌之一，主要定植于人胃内。它是导致慢性胃炎，十二指肠和胃溃疡以及胃癌的一个重要致病因子。除此之外，它还是胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤发展的一个重要因素，WHO将其归为I类致癌因子。幽门螺杆菌感染在全世界广泛流行，研究显示，全球已有48%的人感染这种细菌，发展中国家的感染率高达68%。其主要在儿童期感染，5岁以下幼儿具有较高的再感染率，目前，H.pylori感染临床治疗尚以三联疗法为主。但存在着细菌耐药率逐年增加、患者依从性差、以及容易再次感染等诸多问题。H.pylori感染是一类特殊的感染，它生存于胃粘膜细胞外。根据这一特性，相关研究认为预防和治疗H.pylori感染的主要方式是阻止粘膜发生免疫耐受，并诱导粘膜层产生粘膜免疫应答反应。sIgA作为主要的粘膜保护性抗体，它的主要作用是能够防止细菌和病毒在粘膜表面定植和进一步感染，可抑制细菌抗原的摄取、阻止H.pylori的粘附、移动，以及中和毒素，但其在胃肠外基本无效[1]。因此，目前H.pylori疫苗的免疫接种方法主要是通过口服，由于多数抗原经口服后其免疫原性都非常弱，不能靶向地被运载至肠道的粘膜免疫系统；同时，这些抗原极易被消化和降解，且胃肠的吸收率较低，常规免疫剂量无法刺激机体产生足够的免疫应答反应。要研制有效的H.pylori口服疫苗，除了要确立有效的抗原成分外，选择合适的免疫佐剂非常重要。大量研究证实LTB（大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位）能有效地诱导粘膜免疫的产生，且与LT（大肠杆菌不耐热肠毒素）的另一亚单位LTA（大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位）相比，具有明显的低毒性。由邹全明等人研制的用LTB作为分子内佐剂的口服重组H.pylori亚单位疫苗在临床试验中取得了良好的效果[2]。根据流行病学调查显示，H.pylori的感染在出生后0—1岁就已有发现[3，4]。这样看来，似乎在新生期接种疫苗才能达到预防H.pylori感染的目的。因此，在本实验中选用LTB作为粘膜佐剂，对新生小鼠进行灌胃免疫，并观察其免疫效果。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂与仪器哥伦比亚琼脂培养基、H.pylori培养选择性添加剂购自英国OXIOD公司；布氏肉汤购自杭州天和有限责任公司；三元混合气体（O2、CO2、N2）购自贵阳申建气体有限责任公司；LTB购自Sigma公司；抗H.pyloriIgGELISA检测试剂盒及抗H.pylorisIgAELISA检测试剂盒购自BG公司。恒温培养箱（DHP-9272）购自上海一恒有限责任公司；酶标仪（MK3）购自美国Thermo公司；细菌比浊仪（VITEM004120）购自法国生物梅里埃公司。

1.1.2菌株幽门螺杆菌NCTC11637（购自中国疾病预防控制中心传染病防治研究所）。

1.1.3动物模型BALB/c小鼠（购于中国药品生物制品检定所），清洁级，雌雄兼用，自由饮水，分笼饲养。

1.2实验方法

1.2.1H.pylori灭活全菌体的制备

将NCTC11637接种于含5%无菌脱纤维绵羊血的哥伦比亚血琼脂平板上，置密封的玻璃培养罐内，充入混合气体（O2：5%、CO2：10%、N2：85%），37℃恒温培养，3～4天后取出，用PBS从平板上洗脱，置60℃水浴箱1小时，使细菌灭活，取灭活菌液接种到哥伦比亚血琼脂平板，按上述条件进行培养，3～5天后观察无活菌生长。然后将收集的菌液离心，5000r/min，20分钟，浓缩菌体，去掉上清液，用PBS清洗两次，用比浊法配制成终浓度为2×109/ml的H.pylori灭活菌液，4℃保存备用。

1.2.2LTB的溶解

LTB临用前用500μl超纯水溶解，溶解时轻轻转动，避免产生汽泡，LTB终浓度为1μg/μl，完全溶解后便可使用，余下可放-40℃短期保存备用。

1.2.3实验分組

根椐不同的免疫剂型分为三组（如表1所示）。

表1实验分组

分组疫苗组成对照组（I）（8/group） PBS疫苗A组（II）（8/group） 灭活的H.pylori疫苗B组（III）（8/group） 灭活的H.pylori+LTB1.2.4免疫方法

免疫动物与数量：均为出生后第0天（24h以内）BALB/c小鼠，共24只，16只/每组。免疫剂量：I组为50μlPBS，II组为50ul（含108CFU）灭活全菌，III组为50μl（含108CFU）灭活全菌加5μgLTB。免疫时间：出生后第0、7、21天。第0天灌胃两次，两次中间隔6小时；第7、21天各免疫1次。免疫程序：第0天免疫时，将24小时以内出生的BALB/c小鼠与母鼠分离3小时后，进行灌胃，灌胃完毕，继续放入笼中（与母鼠隔离），4小时后，再次按照上述方法给予第二次灌胃，免疫结束2小时后，将母鼠放回笼中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，与母鼠隔离6小时，免疫方法同前，免疫2小时后放回母鼠笼中。第21天免疫前断食24小时，断水4小时以后进行灌胃，免疫2小时后恢复食水。

1.2.5抗H.pyloriIgG、sIgA检测

1.2.5.1标本采取

实验组取末次免疫两周后（第35天）小鼠，断食12小时，断水4小时，摘除眼球取血，置37℃半小时后，分离血清，-20℃保存备用，检测特异性IgG。将取血致死的小鼠腹部剪开，从贲门处到幽门处剪取胃组织，去除胃内容物，用小剪刀将胃组织剪碎，再移置200目不锈钢网上，然后加入1ml蒸馏水进行研磨，将研磨后的细胞悬液离心，5000r/min，离心20分钟。取上清液，-20℃保存备用，检测特异性sIgA。

1.2.5.2血清特异性IgG检测

按照BG公司ELISA试剂盒说明书进行检测。终止反应后30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值，绘制标准曲线，计算浓度值。

1.2.5.3胃组织标本特异性sIgA检测

按照BG公司ELISA试剂盒说明书进行检测。终止反应后5分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值，绘制标准曲线图，计算浓度值。

2结果（用SPSS17.0进行统计学分析）

各组血清特异性IgG，胃粘膜特异性sIgA浓度（如表2、图1、2所示）

从表3-1中可以看出第Ⅲ组的特异性IgG及sIgA浓度明显高于第Ⅰ、Ⅱ组，其中，Ⅱ组IgG浓度与Ⅰ、Ⅲ组相比，结果具有统计学意义（P<0.05），Ⅲ组IgG浓度与Ⅰ、Ⅱ组相比，结果亦具有统计学意义（P<0.05）；Ⅲ组sIgA浓度分别与Ⅰ组和Ⅱ组相比，结果具有统计学意义（P<0.05），Ⅰ组与Ⅱ组sIgA浓度无统计学意义（P>0.05）。

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4讨论

早在90年代初期，有关H.pylori疫苗的研究就已经开始。近年来，有着各种各样关于H.pylori疫苗的研究。根据疫苗的构成不同，可将其分为全菌疫苗、亚单位疫苗、表位疫苗、载体疫苗等。亚单位疫苗的结构与组成较为明确，是可引起免疫保护的一类蛋白质、脂多糖等微生物组分。与亚单位疫苗相比，全菌疫苗的优点是能诱发针对细菌各种抗原的免疫应答[5]。但是这些蛋白介导的免疫应答机制仍然不十分清楚，另一方面，现在仍然不能确定对H.pylori整个菌体有效的理想疫苗，应该诱导的免疫应答的效应因子是什么（例如抗体、CD4+亚群、细胞因子等）。本实验通过检测抗H.pylori特异性IgG及sIgA来观察用灭活H.pylori加或不加LTB灌胃免疫新生小鼠后，能否诱导机体产生特异性免疫应答。结果显示，抗H.pyloriIgG及sIgA浓度有所增高，提示灭活幽门螺杆菌加LTB能诱导机体免疫系统产生特异性的全身及粘膜免疫反应。虽然灭活H.pylori不加LTB组IgG浓度的增高与PBS组相比较具有统计学意义，但该组特异性sIgA却未见明显增高，这一结果证明了抗原经消化道免疫的特殊性（极易被消化和降解）及佐剂在粘膜免疫中的重要性[6]。因蛋白质包括疫苗到达粘膜诱导部位是一种诱导全身无应答性（粘膜诱导耐受性）的有效途径，虽然粘膜诱导耐受是防止自身免疫疾病的有效途径，但此特征可导致宿主对感染应答能力的丧失[7]。本实验用LTB作为粘膜免疫佐剂，试图增强灭活H.pylori在胃粘膜的的抗原性，结果显示特异性IgG及sIgA抗体浓度较不加LTB组显著增高，提示用LTB作为佐剂用于新生BALB/c小鼠的消化道粘膜免疫是可行的，这一结果与文献报道相符[12]。虽然sIgA是公认的粘膜表面主要的免疫球蛋白，是机体抵抗外来病原体的第一道防线，它们帮助机体抵御病原体经由粘膜上皮的感染，防止病原体和毒素进入细胞[8]。但新生期免疫产生的这两种抗体对于H.pylori的感染是否有免疫保护作用，我们将进一步进行探索研究。

参考文献

[1]刘开云，邹全明.幽门螺杆菌全菌疫苗研究进展[J].第三军医大学学报，2004；26（20）：1881-1883.

[2]邹全明.幽门螺杆菌疫苗的研究进展[J].胃肠病学，2007；12（9）：567-570.

[3]王丽媛，毛萌，汪志凌，etal.成都市城区儿童幽门螺杆菌感染调查[J].预防医学情报杂志.2014；30（5）：349-352.

[4]RothenbacherD，InceogluJ，BodeG，etal.AcquisitionofHelicobacterpyloriinfectioninahigh-riskpopulationoccurswithinthefirst2yearsoflife[J].JPediatr，2000；136（6）：744-748.

[5]閆东梅，朱迅.治疗性疫苗的发展现状与应用前景[J].中国生物制品学杂志，2005；18（6）：535-537.

[6]HolmgrenJ，AdamssonJ，AnjuèreF，etal.Mucosaladjuvantsandanti-infectionandanti-immunopathologyvaccinesbasedoncholeratoxin，choleratoxinBsubunitandCpGDNA[J].ImmunolLett，2005，97（2）：181-188.

[7]吴玉章，白云，程晓刚，etal（译）.基础免疫学[M].北京：科学出版社，2003，1023.

[8]何维.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2005，76.