硫酸铵在蛋白质含量测定中的参比作用初探

王亚棋 黎隽 刘立科等

【摘要】目的 中国药典2010版附录Ⅶ D 氮测定法第二法，是蛋白质含量测定的经典方法。但参考蛋白难于获得，检测结果缺乏参比性。本文尝试以分析纯硫酸铵为参考品，检测关节软骨再生支架样品中的蛋白质含量。方法 分别称取三份硫酸铵，与蛋白样品一起，在相同条件下测试其回收率，用以参照评价蛋白样品的检测结果。结果 硫酸铵的回收率接近100%，不考虑消化样品的差异，可以确认样品测定结果。 结论 在没有标准蛋白作参比的情况下，在凯氏定氮法中引入硫酸铵，可以很好的监测实验结果。

【关键词】蛋白质；测定；硫酸铵

【中图分类号】R151.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0011-01

蛋白质是由氨基酸以酰胺键（ 肽键） 相结合形成的结构极其复杂的高分子化合物， 是生物体中的主要含氮物质。蛋白质与细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质转运和遗传等密切相关， 蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物科学、食品检验、临床检验、疾病诊断和质量检验中最重要的工作。蛋白质测定方法一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法。直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质， 直接测定蛋白质含量的方法。多年来， 利用蛋白质的主要性质（ 如含氮量、肽键、折射率等） 和利用蛋白质含有的特定氨基酸残基（ 如芳香基、酸性基、碱性基等） ， 测定蛋白质的方法不断发展， 主要有凯氏定氮法（ 国际经典测定方法） 、分光光度法、电化学法、滴定法、高压液相色谱法、电泳法、免疫法等[1]。蛋白质是食品中的重要营养成分，也是评价食品营养价值的重要指标之一[2]，随着科学技术的向前发展，蛋白质被引入到很多医疗器械中，并成为评价该医疗器械质量的重要指标。在运用凯氏定氮法测定其蛋白质含量时，常常没有合适的标准参考蛋白，而且在不同参考蛋白模式下得到的评价差距较大，在作为蛋白质生物价的估计时不够理想和满意[3]。为此。我们选用硫酸铵作对照，起到了一定的参比作用。

凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏和吸收、滴定等过程。在催化剂作用下， 试样用浓硫酸消煮破坏有机物， 使其中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮， 然后与硫酸结合生成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出， 用硼酸吸收后， 再用酸滴定， 测出含氮量， 将结果乘以换算系数， 计算出粗蛋白质含量[4-6] 。它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。通常认为该法关键环节有浓硫酸用量、催化剂选择、消化时间、氢氧化钠用量和硼酸吸收液指示剂选择等[1]。但在我们的实践中发现，在用标准硫酸溶液进行滴定时，特别是在使用全自动点位滴定仪时，终点的选取也很关键。这时选用合适的参照品就很重要了。为此，我们就用硫酸铵解决了这一问题。

材料和方法

1.实验器材：

半微量法凯氏定氮仪、50ml凯氏烧瓶、移液管、滴定管、锥形瓶、试管、电子万用炉、容量瓶、电子天平

2.试剂：

关节软骨再生支架、分析纯硫酸铵、稀硫酸、甲基红指示液、30%硫酸铜溶液、2%硼酸溶液、甲基红-溴甲酚绿混合指示液、40%氢氧化钠溶液、0.05mol/L硫酸滴定液、0.005mol/L硫酸滴定液、硫酸钾、硫酸

3.试验步骤：

按照《中华人民共和国药典2010年版二部》附录Ⅶ D 氮测定法第二法所示，连接蒸馏装置，在1000mL圆底烧瓶A中加水适量（约500mL）和甲基红指示液8滴，再加稀硫酸使成酸性，加沸石5粒，从漏斗D中加水约50mL，关闭漏斗与连有氮气球的蒸馏器之间的橡皮管夹。开放冷凝水，煮沸1000mL圆底烧瓶A中的水，当蒸汽从冷凝管尖端冷凝而出时，移去火源，关闭1000mL圆底烧瓶A与安全瓶连接的橡皮管夹，使连有氮气球的蒸馏器中的水反抽到安全瓶，放开与漏斗连接的橡皮管夹，放出安全瓶中的水，关闭安全瓶与漏斗连接的橡皮管夹，将冷凝管尖端插入约50mL水中，使水自冷凝管尖端反抽至连有氮气球的蒸馏器瓶C，再抽至安全瓶B中，如上法放去。如此将仪器内部洗涤3次。

按实验设计，分别取供试品和对照品适量（约相当于含氮量1.0～2.0mg），精密称定，置干燥的50mL凯氏烧瓶中。加硫酸钾0.3g与30%硫酸铜溶液5滴，再沿甁壁滴加硫酸2.0mL；在凯氏烧瓶口放一小漏斗，并使凯氏烧瓶成45°斜置，用小火缓缓加热使溶液保持在沸点以下，等泡沸停止，逐步加大火力，沸腾至溶液成澄明的绿色后，继续加热10分钟，放冷，加水2mL。

取2%硼酸溶液10mL，置100mL锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液5滴，将冷凝管尖端插入液面下。然后，将凯氏烧瓶中内容物经由漏斗转入连有氮气球的蒸馏器C中，用水少量淋洗凯氏烧瓶及漏斗三次，再加入40%氢氧化钠溶液10mL，用少量水再洗漏斗三次。关闭漏斗与连有氮气球的蒸馏器之间的橡皮管夹，加热1000mL的圆底烧瓶A进行蒸气蒸馏，至硼酸液开始由酒红色变为蓝绿色时起，继续蒸馏约10分钟后，将冷凝管尖端提出液面，使蒸气继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏。

结 果

取馏出液用0.005mol/L的硫酸標准溶液滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。下表为检测结果。不论是样品还是对照品硫酸铵，都得出了平行性较好的结果。具有一定的可信度。

计算公式：

6.25---氮换算蛋白质的系数；

讨 论

针对实验室在检测检验过程中缺乏蛋白质权威计量方法、标准物质及校准规范造成蛋白质相关医疗器械无法检定校准的问题，着重进行蛋白质含量和分子量权威计量方法研究、检定校准用蛋白质标准物质研制以及蛋白质相关医疗器械校准规范起草工作，非常必要。在此之前，利用凯氏定氮法的相关原理，引入硫酸铵等作为对照，可以增加检测检验结果的信心。

样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量。 一是脱水作用， 将样品中有机物脱水然后碳化成C；二是氧化作用， 浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达到400摄氏度以上， 碳还原硫酸生成SO2，而碳本身被氧化成CO2；三是分解作用， 将蛋白质分解， SO2 还原N生成铵根离子NH+4 ， 本身被氧化成SO3；四是吸收作用， 生成的铵根离子NH+4与浓硫酸反应生成硫酸铵（NH4）2SO4；五是生成的（NH4）2SO4保存在浓硫酸溶液中不至于损失[ 5， 7] 。样品消化过程要加入催化剂， 加入硫酸钾能够提高分解时溶液的温度， 使溶液沸点由290 摄氏度提高到400摄氏度。加入硫酸铜、氧化汞和硒粉则能促进试样的分解， 缩短消化时间。有试验证明， 用硒粉作催化剂可加快消化速率， 缩短试样消化时间， 其测定结果与硫酸铜作为催化剂的传统方法相当吻合[8] ， 但硒粉使用量过多或与硫酸作用时间过久会使铵态氮成为分子氮而损失[9] 。虽然加入氧化汞能够节省消化时间， 但由于污染较重， 多用于仲裁检验[8]。目前包括国标方法大多加入硫酸钾和硫酸铜混合催化剂，但众多文献中二者用量的比例有所不同， 硫酸钾B硫酸铜比例主要有15：1、10：1、10：0.9 和9：1等[ 2- 3， 8- 9] ， 国标方法采用10：1比例， 硫酸铜用量是影响消化时间的主要因素[10] 。样品消化过程中， 消化液经过一系列改变最终转变为绿色透明状态， 这种过程是碳化的有机物完全被氧化的变化， 但决不表示样品中的氮素全部转变为NH+4 。蒸馏过程中加入40%氢氧化钠溶液， 用于中和样品消化后剩余的浓硫酸， 并使（NH4）2SO4转化为NH4OH， 经加热生成NH3逸出， 被硼酸吸收。为使样品消化液中的（NH4）2SO4全部转化为NH4OH，40% 氢氧化钠溶液必须过量加入， 用量不够会造成测定结果偏低， 用量过多则浪费试剂[6] 。硼酸吸收液中混合指示劑的组成和配方有数种， 如溴甲酚绿- 甲基红、甲基红- 甲基蓝、甲烯蓝- 甲基红等， 但以0.5%溴甲酚绿乙醇溶液和0.1%甲基红乙醇溶液混合而成的混合指示剂变色比较敏感。指示剂与硼酸吸收液的比例通常使用1：100或2：100。虽然，以硫酸铵作为对照，不能表示蛋白消化游离出氮的程度，却可以较好监测后续的实验状况。

考虑到硫酸与碳酸钠的反应有两个不同的终点：2Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+2NaHCO3，Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+H2O+CO2↑，标定硫酸时要注意选择合适的指示剂和对应的反应式进行计算。特别是利用全自动电位滴定仪进行标定时，如果选用标准方法[11]，采取硫酸去滴定碳酸钠时，要注意选用硫酸的物质的量的基本单元是[c（1/2H2SO4）]而非[c（H2SO4）]。

参考文献

[1] 路苹，于同泉，王淑英，王建立，杨柳. 蛋白质测定方法评价[J]. 北京农学院学报， 2006， 2（21）： 65-69.

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[3] 颜孙安，林香信，钱爱萍，姚清华. 化学分析法的理想参考蛋白模式及其化学生物价研究. 中国农学通报， 2010， 26（23）：101-107

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[10] 王 雅.蛋白质测定实验的研究[J]. 实验室研究与探索，2005， 24（4）： 58-59

[11] GB/T 601-2002.化学试剂标准滴定溶液的制备[S]. 北京：中国标准出版社，2003：