荧光定量PCR检测HBV—DNA与ELISA检测乙肝两对半700例样本分析

王莉萍　屈雪琴　郎玉霞

【摘 要】目的：分析乙肝病毒核酸（HBV-DNA）含量检测的结果及其与乙肝血清标志物检测结果的一致性。方法：用荧光定量PCR和ELISA两种方法检测700 份乙肝患者血清，并对其结果进行分析[1]。结果：700 例HBV-DNA定量检测阳性355例，阴性345例；大三阳检出共254例，阳性检出率98%，平均拷贝数4.38E+06/ml；小三阳检出共333例，阳性检出率19.5%，平均拷贝数3.98E+04/ml；表面抗原（HBs-Ag）和核心抗体（HBc-Ab）阳性检出共100例，阳性检出率33%；平均拷贝数2.71E+04/ml；表面抗原（HBs-Ag）和e抗原（HBe-Ag）检出共13例，阳性检出率61.6%，平均拷贝数6.21E+06/ml。结论：乙肝患者两对半检出的各种类型中均有病毒复制和无复制现象，大三阳中以复制为主，但也有少许无复制患者，小三阳以无复制为主，但也有部分患者出现复制现象，一般处于低复制状态[2]。纵观所有， HBe-Ag在阳性的情况下HBV-DNA检测出的阳性率也高，二者呈正相关[3]，鉴于这些情况运用PCR技术定量检测HBV-DNA能准确反映HBV的真实感染和复制情况[4]。两者联合检测在临床乙型肝炎诊断、治疗、预后方面有重要意义。

【关键词】乙型肝炎病毒；PCR；ELISA

乙肝病毒感染的诊断主要依赖于测定血清中乙肝病毒抗原一抗体标志物和乙肝病毒核酸（HBV-DNA）含量，为了解彼此间的关联性，作者运用两种方法检测乙肝患者血清，并对其结果进行对比分析，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

所有标本来自2012年6月至2013年12月岷县人民医院住院及门诊病人的血清标本。

1.2 仪器与试剂

血清HBV-DNA检测使用广州中山达安荧光定量PCR检测仪DA-7600，试剂来自广州达安股份有限公司生产试剂盒。血清乙肝抗原一抗体标志物检测采用深圳雷杜酶标仪，上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 HBV-DNA采用核酸扩增（PCR）荧光定量检测法，用已知含量梯度（2.0×10^6，2.0x10^5，2.0×10^4，2.0×10^3）的HBV-DNA标准品为参照物，经荧光定量PCR扩增后所得荧光值经数据转换，制出一条标准曲线，待测样品的荧光值进行对比得出其样本DNA含量。检测中同时设置阴阳性对照。严格按照试剂盒操作要求，在对样本做了预处理之后取2ul上清液加入反应管上机，按下列条件进行扩增：①先93℃2min；②然后按93℃45s～55℃60s10个循环后进入下一环节；③93℃30s～55℃45s 30个循环后，反应结果由仪器自动分析，直接得出血清标本的病毒拷贝数。

1.3.2 乙肝五项采用 ELISA法测定，试剂盒购自上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒，操作严格按照试剂盒说明。

1.4 结果判断

根据试剂盒说明 PCR 荧光定量<1×1O^3拷贝数/ml为无复制，判断为阴性。≥1.1×10^3拷贝数/ml为病毒复制，判断为阳性。

1.5 统计学处理

各种类型人为分组，见下表。 HbsAg-HbeAg-HbcAb（1，3，5） 阳性， HbsAg-HbeAb-HbcAb（1，4，5） 阳性，HbsAg- HbcAb（1，5）阳性，HbsAg-HbeAg（1，3）阳性，HbsAg（1阳），乙肝病毒标志物与荧光定量PCR 扩增结果相互比较，得出比率。

2 结果

700 例HBV-DNA定量检测结果中，345例HBV-DNA阴性，355 例阳性；>10^5拷贝例数252例。EIISA检测HBV标志物与HBV-DNA含量的结果比较，乙肝HbsAg，HbeAg，HbcAb阳性组（俗称大三阳）254例，其中HBV-DNA阳性检出率为98%，阴性检出率为2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb 阳性组（俗称小三阳）333例，标志物中所占比例最高[5]，HBV-DNA陽性检出率为19.5%，阴性检出率为80.5%；HbsAg-HbcAb阳性100例，阳性检出率为33%，阴性检出率为67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率为61.6%，阴性检出率为38.4%。HbsAg阳5例，阳性检出率为0。

3 讨论

荧光定量PCR方法，是使分析扩增产物全过程在一个封闭体系下完成，并且进行实时动态监测，图形直观，自动得出定量结果，且结果具有更高的特异性和敏感性。本组HBV-DNA定量结果显示，700例病人血清PCR阳性检出率达50.7（355/700）， HbsAg，HbeAg，HbcAb 阳性组（俗称大三阳）254例，其中HBV-DNA阳性检出率98%；>10^5以上210例，占83%；阴性检出率2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb阳性组（俗称小三阳）333例，HBV-DNA阳性检出率19.5%，>10^5以上23例，占6.9%，阴性检出率80.5%；HbsAg- HbcAb阳性100例，阳性检出率33%，>10^5以上，11例，占11%，阴性检出率67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率61.6%，>10^5以上，8例，占61.6%，阴性检出率38.4%。资料显示，大三阳也有少量病例病毒不复制，即为阴性。而小三阳，主要为阴性，但也有部分病例出现阳性结果。小三阳患者中HbeAb的出现，传统认为乙肝病毒DNA 含量下降，传染性降低.但实际并不表示患者体内已没有病毒复制， （下转至第40页）

（上接至第22页）

由于HbeAg前体的分泌变异可以在血清中不表达出HbeAg，因而HbeAg阴性仍可引起宿主持续免疫应答，表现为HbeAb阳性，故小三阳患者同样有传染性。至于其他类型有阴有阳，分析提示HbeAg的存在与HBV-DNA浓度有高度的相关性，此时肝炎病毒可能处于复制期，传染性较强。

乙肝病毒在患者血清中有三种存在形式：球形颗粒、管形颗粒和完整的Dana病毒颗粒。Dana颗粒中含有HBV-DNA，而球形、管形颗粒不含DNA。ELISA法测定为乙肝病毒所编码表达的蛋白质（多肽）抗原或相应抗体，当病毒抗原一抗体在血清中达到一定浓度即可检出这些标志物[6]。荧光定量PCR虽具有污染少，特异性和敏感性高的特点，但在分析定量结果时还应考虑：①如荧光定量PCR反应体系复杂易受多种因素影响，如待测标本溶血，前期处理不当，难以避免的污染仍会造成假阴性或假阳性结果；②PCR只能检测血中游离的HBV-DNA，当病毒整合到肝细胞染色体上随肝细胞一同复制表达时，ELISA法可能检出乙肝标志物，但PCR荧光定量可能低于阳性界；③当患者感染的HBV-DNA发生突变不能与荧光探针结合时，ELISA法可出现阳性反应而PCR荧光定量为阴性；④患者处于恢复期或继往感染时，HBV病毒被清除，荧光定量PCR视为阴性，而此时HbeAb，HbcAb还可在一段时间内保持阳性。因此，乙肝病毒所编码表达的蛋白质抗原或相应抗体阴性或假阳性结果由多种原因造成的，临床诊断应根据HBV-DNA定性或定量及乙肝表面标志物检测结果综合分析。

综上所述，ELISA法检测乙肝标志物与荧光定量PCR检测HBV-DNA二者互有联系但又不尽相同。前者能反映HBV感染的不同时期状况，可以提示疾病的转归趋势；而后者是直接对血液中的病毒DNA定量，更能反映HBV病毒的感染与复制程度。因此，在乙肝的诊疗中，正确地应用乙肝标志物和HBV-DNA的检测，有助于疾病的觀察、用药、提高疗效及判断预后。

参考文献

[1]吕世琪，张金良，闫奇.乙肝五项指标与荧光定量PCR检测血清HBV-DNA含量联合运用[J].实验与检验医学，2011，29（6）：641-642.

[2]曾宏辉.PCR 荧光定量检测乙肝病毒核酸的结果分析[J].医学临床研究，2006，23（9）：1462-1463.

[3]郭卉，董瑶佳，刘晓峰，等.乙肝血清学标志物与HBV-DNA含量关系的分析[J].实验与检验医学，2010，（4）：211-212.

[4]张银华.乙肝五项检测与HBV-DNA定量的相关性对乙型肝炎诊断分析[J].大家健康（学术版），2012，6（12）：43-44.

[5]徐光明，贺欣，袁水斌，等.血清乙肝五项模式与HBV-DNA水平之间关系及其临床应用[J].实验与检验医学，2009，（6）：661-662.

[6]张丽虹，孙德伟，魏嵘琪，等.HBsAg阳性的招待所服务人员血清乙肝五项指标的调查[J].中外医学研究，2011，（10）：92.