橡胶草根部离体培养诱导植株的研究

贾瑞 吴坤鑫 王颖 贾贤 陈雄庭

摘 要 以橡胶草的根部作为外植体进行组织培养和快速繁殖研究。结果表明：橡胶草根部外植体防止褐化的最佳方法为MS+500 mg/L AC预培养3 d；根部愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.6 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L 2，4-D，平均诱导率为90%；分化培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA；生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA。

关键词 橡胶草；愈伤组织；再生体系

中图分类号 S567 文献标识码 A

橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）， 是菊科（Compositae）蒲公英属（Taraxacum）的多年生草本植物。橡胶草具有较强的生长繁殖能力，能够生长在较寒冷的地区，产生优良种子，极容易种植，并且具有较强抗菌能力和抗虫害能力。橡胶草外形与蒲公英非常相似，但根部可以分泌与巴西橡胶树成分相当的优良天然橡胶，其干重约占根部成分的20%[1-2]，在工业上有重要的利用价值，可为缓解我国橡胶产业不足，依赖进口的现状提供支持。橡胶草的生长较巴西橡胶树而言，适宜栽培的地区广，适应性强，生长速度快，在我国华东、华北、东北和西北等地区均适宜进行橡胶草的种植，是极具经济发展前途的产胶植物[3]。

目前国外学者对橡胶草的研究从形态结构、组织生理、栽培技术等方面转向对橡胶草的产胶蛋白颗粒及相关的酶进行分子生物学研究[4-6]，而国内学者也开始从形态学方面研究逐渐向分子遗传转化方向发展，并已通过叶片作为外植体，初步开展了橡胶草再生体系的研究[7-9]。但由于目前再生体系并不够成熟，发展进度较为缓慢。本文以橡胶草根部为材料进行愈伤组织的诱导、分化以及生根的研究，为橡胶草组培快繁和遗传转化体系的建立奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取中国热带农业科学院热带生物技术研究所橡胶树细胞工程研究室种子繁殖的试管苗为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制 以MS为基本培养基，添加3 g/L蔗糖和5 g/L琼脂粉，根据试验设计，在不同培养阶段附加不同浓度的植物生长调节剂，pH调至（5.8±0.1），121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，分装于组培瓶或培养皿中备用。

1.2.2 材料的处理 将保存于培养箱内的橡胶草试管苗进行生根培养，待根长达5 cm以上时，将根切成长约1.5～2 cm的小段备用。

1.2.3 外植体的的预培养 在MS基本培养基中分别加入活性炭300、500、700 mg/L，并以不添加活性炭MS作为对照。每个处理接种到5个培养皿，每个培养皿接种5个外植体，3次重复，（23±2）℃进行暗培养，3、7、10 d后分别对其进行观察统计。褐化率（%）=外植体褐化数/接种外植体数，死亡率（%）=外植体死亡数/接种外植体数。

1.2.4 愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基，根据试验要求附加不同浓度的2，4-D和6-BA，每个处理接种5个培养皿，每个皿接种5个外植体，3次重复。在光照周期为14 h/d，温度为（23±2）℃，光照强度为1 800～2 000 lx的条件下培养，7 d后对其进行观察统计。愈伤组织的诱导率（%）=产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数。

1.2.5 诱导愈伤组织分化 将绿色、颗粒状、质地坚硬的愈伤组织接种于附加不同浓度NAA和6-BA的MS培养基上，每个处理接种5个培养瓶，每瓶接种3个外植体，3次重复。在光照周期为14 h/d，温度为（25±2）℃，光照强度为1 800～2 000 lx的条件下培养，7 d后对其进行观察，14 d后对其进行统计。诱导率（%）=产生分化的愈伤组织数目/接种愈伤组织的数目。

1.2.6 生根培养 待苗长到3 cm左右的時候转入的生根培养基中诱导根的产生。在光照周期为14 h/d，温度为（25±2）℃，光照强度为1 800～2 000 lx的条件下培养，14 d后对其进行观察统计。生根率（%）=生根苗数/总的接种苗数。

1.2.7 炼苗与移栽 将株高5 cm以上，根长5 cm左右的橡胶草组培苗进行炼苗移栽，移栽前先将组培苗的瓶盖打开一半放置于阴凉的地方3 d后，将幼苗基部的琼脂洗净，用0.1%的多菌灵浸泡30 min，然后将其移栽到小盆中，移栽基质为营养土 ∶ 砂石 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1的混合基质。移栽后先将苗放置于光照强度为1 800～2 000 lx的培养箱预炼苗7 d，然后再将其完全暴露于自然的环境下。

1.3 数据分析

该试验数据采用SAS 9.0数据处理系统进行数据分析。试验中所获得的各处理数据均先进行方差分析，在p﹤0.05水平上，采用LSD法做多重比较[10-11]。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度活性炭和处理时间对外植体褐化率和死亡率的影响

由表1可知，在未添加活性炭的培养基中，接种3 d，外植体切口开始出现褐化（图1-A），接种7 d后整个外植体褐化，随后死亡（图1-B），在培养基中添加500 mg/L的活性炭，外植体接种7 d后，只有少数出现褐化现象，抑制褐化的效果好，且对外植体的伤害最小（图1-C）。但当活性炭浓度增加到700 mg/L，接种7 d后，褐化虽然得到一定程度的抑制，但外植体开始变黄，随后慢慢死亡（图1-D），说明活性炭的吸附作用没有选择性，在吸附有毒物质的同时也吸收培养基里的营养元素，从而导致外植体的死亡。在相同活性炭浓度的不同组合中，褐化率和死亡率总体上随着时间的增加而增加。从褐化率的多重比较结果可知，处理7、8、9、10之间差异不显著，且极显著的低于其他处理组，其中处理7、10均值最低，且都为0.00%，但处理10逐渐出现死亡现象，从节约成本和时间的因素考虑，选择处理7作为抑制外植体褐化现象的最佳处理。从死亡率的多重比较结果可知处理7、8、9、10之间无显著差异，且极显著的低于其他处理组，其中处理7、8、10均值最低都为0.00%，但处理10逐渐出现死亡现象，综合考虑，选择处理7作为抑制外植体褐化现象的最佳处理。故根部作为外植体时，选择处理7作为抑制外植体褐化现象和死亡现象的最佳处理，即MS+500 mg/L AC预处理3 d。

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