离子交换层析法分离猪股骨降血压肽的研究

舒一梅，李　诚，郑丽君，潘姝璇，陈　娜，郭　威，王诗熠，付　刚（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

离子交换层析法分离猪股骨降血压肽的研究

舒一梅，李诚*，郑丽君，潘姝璇，陈娜，郭威，王诗熠，付刚
（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后，为了得到高活性且纯度较高的降血压肽，采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱液pH、离子强度、流速三个因素进行研究，确定了最佳分离条件：以pH=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液、B液为含1mol/LNaCl的pH=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗脱流速为0.8mL/min。结果显示：离子交换层析分离得3个组分，其中组分1的活性最高，其IC50值为0.1012mg/mL；再利用凝胶层析将组分1进行脱盐，其峰2的IC50值达到0.0836mg/mL，脱盐率达到86.60%±0.5%。

酶解，降血压肽，离子交换层析，凝胶层析，ACE半抑制浓度

降血压肽具有来源广泛、降压效果理想、天然低毒副作用等特点，是国内外一直研究的热点。利用廉价的猪股骨为原料，采用酶解的方法可以得到具有降血压活性的酶解液，但酶解液组成成分复杂，不利于降压产品的开发，必须进一步分离纯化［1-2］。离子交换层析是发展最早的层析技术之一，与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化［3-4］，具有灵敏度高、重复性、选择性好、分析速度快等特点，常用的有离子交换树脂、离子交换葡聚糖、离子交换纤维和离子交换琼脂糖等。目前，离子交换色谱已经成为分离提取生物活性肽的最常用的有效方法，生物活性肽通过静电作用与固定相中的带电基团结合，由于不同活性肽具有不同电荷和电荷量，所以解吸及移动速度不同，从而可以实现分离［5-6］。

本实验室所制备酶解液经超滤、凝胶层析分离之后得到的组分纯度不高，为得到纯度较高的高活性降血压肽，采用离子交换层析进一步分离，以期分离出高纯度的猪股骨降血压肽，开发以其为功能因子的保健食品或治疗高血压的药物具有较高的实用价值。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

猪股骨骨粉实验室自制；Sephadex G-25 BIORAD公司；阳离子交换树脂BIORAD公司；木瓜蛋白酶（800U/mg）、风味蛋白酶（20U/mg）、碱性蛋白酶（200U/mg） DSM公司；ACE、HHL美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

蛋白层析仪BIORAD公司；超滤管（5ku） 密理博公司；QT-2漩涡混匀器上海琪特分析仪器有限公司；UV-3200 MAPADA紫外分光光度计；冷冻干燥机、高速冷冻离心机、移液枪Thermo Fisher；超纯水装置优普公司；pH计方舟科技；层析柱1.6cm× 60cm1cm×20cm上海沪西分析仪器厂；BSZ-100型自动部分收集上海沪西分析仪器厂；WLB-78C恒流泵浙江新昌国康仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1猪股骨降血压肽的制备按照实验室前期猪股骨酶解降血压肽的优选条件制备猪股骨降血压肽，其工艺流程为：新鲜猪股骨→清洗→高压蒸煮→粉碎→加酶水解→灭酶→离心→上清液→冷冻干燥［7］。将酶解液用截留分子质量为5ku的超滤管进行超滤，冻干备用。1.2.2凝胶层析分离将超滤后分子量＜5ku的滤液通过Sephadex G-25进行凝胶层析分离，分离条件为：去离子水为洗脱液，控制流速为0.6mL/min，上样量为1%（以床体积的百分比计算），检测波长为214nm。

1.2.3离子交换层析分离操作步骤根据目的多肽的性质来选择合适的离子交换填料［8-9］。本实验选用UNO-S阳离子交换树脂进行分离［10-11］。为了达到最好的分离效果，本实验探讨了洗脱液pH、离子强度以及流速对分离效果的影响。

采用蛋白层析仪对收集凝胶层析后的高活性组分进行线性梯度洗脱，以UNO-S阳离子交换树脂为填料。用超纯水将蛋白层析仪的AB泵冲开，用A（不同pH的0.05mol/L磷酸盐缓冲液）液平衡柱子，再上样（每一条件进行6次以上平行实验，直到每次平行实验的分离图谱一致）。利用A液和B液（含1mol/L NaCl的不同pH的0.05mol/L磷酸盐缓冲液）进行线性梯度洗脱，其洗脱程序为：A液100%～0、B液0～100%，收集洗脱液，清洗交换剂、管道和装置。结合每管在214nm的吸光度值，考察不同流速、离子强度、pH对分离效果的影响，测定各组分IC50值，收集体外ACE抑制率最高的组分。

1.2.4单因素实验

1.2.4.1不同pH洗脱液对分离效果的影响B液为含1mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，控制流速为1mL/min。分别采用不同pH的0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液，设定不同pH为：6.0、6.5、7.0，研究不同pH的洗脱液对分离纯化效果的影响，确定最适pH。

1.2.4.2不同离子强度对分离效果的影响采用pH=6.5，0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液，B液为含不同量NaCl的pH=6.5，0.05mol/L磷酸盐缓冲液，控制流速为1mL/min，设定不同离子强度（mol/L）为：0.5、1.0、1.5。考察不同离子强度对分离纯化效果的影响，确定最适离子强度。

1.2.4.3不同流速对分离效果的影响采用pH= 6.5，0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液，B液为含1mol/L NaCl的pH=6.5，0.05mol/L磷酸盐缓冲液，设定不同流速（mL/min）为：0.8、1.0、1.2。考察不同流速对分离纯化效果的影响，确定最适流速。

1.2.5脱盐经离子交换层析后，得到的高活性猪股骨降血压肽组分含有大量的盐，为了进一步提高其ACE抑制活性，采用Sephadex G-25为填料，对该组分进行脱盐，重复该实验6次［12-13］。采用国标中的硝酸银滴定法测定脱盐率［14］。

1.2.6指标的测定

1.2.6.1ACE抑制率的测定ACE抑制率的测定主要采用紫外分光光度法［15-16］。

1.2.6.2IC50值测定方法将样品配制成不同的浓度（实验点≥5），分别测定其ACE抑制率，以样品浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标，绘制圆滑曲线，用对数几率图解法计算出IC50值。

1.2.6.3蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定主要采用Lowry法蛋白含量检测试剂盒测定。

2　结果与分析

2.1凝胶层析分离

分离出的组分2的抑制率最高，如图1，经计算其IC50值为0.4016mg/mL。

图1　凝胶层析分离曲线Fig.1　The separation pattern of gel chromatography

2.2离子交换层析分离

2.2.1不同pH洗脱液对分离效果的影响由图2知，洗脱液的pH对分离效果影响较大，当pH为6.0时，可以得到3个峰，当pH为6.5时，也能得到3个峰，但与pH=6.0相比，峰1峰型较圆、峰2和峰3分离程度不如前者，当pH为7.0时，只能得到2个峰，分离效果不佳，因此洗脱液的pH选用6.0。

2.2.2不同离子强度对分离效果的影响由图3知，离子强度对分离效果影响并不大，在各个离子强度下，都分离出了3个峰，综合考虑成本以及峰型这两方面，采用1mol/L的离子强度较合适。

2.2.3不同洗脱流速对分离效果的影响由图4知，流速对分离效果影响较大。在流速为0.8、1.0mL/min的条件下，能分离出3个峰，前者峰1较后者尖，前者分离较好。但当流速为1.2mL/min时，只能得到2个峰，未能分开峰2与峰3。因此，为了保持较高的分离效果，采用0.8mL/min的分离速度。

2.2.4确定最佳分离条件综合以上得出最佳洗脱条件：采用pH=6.0磷酸盐缓冲液为A液，B液为含1mol/L NaCl的pH=6.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗脱流速为0.8mL/min。将凝胶层析分离后的组分2冷冻干燥配成蛋白质浓度为10mg/mL，按优选的最佳分离条件再进行多次验证，如图5。在此区间形成3个洗脱峰，分别测定IC50值。测得其中组分1的抑制率最高，如图6，其IC50值为0.1012mg/mL，表明该分离条件稳定可行。

图2　不同pH的分离图谱Fig.2　The separation pattern of different pH

2.2.5脱盐离子交换层析后所得到的组分1经凝胶层析脱盐后，得到了两个洗脱峰，通过测定其IC50值，发现峰2有较高的ACE抑制活性，其IC50值为0.0836mg/mL（峰1 IC50值为0.3612mg/mL），较脱盐之前活性提高了1.3倍，其脱盐率达到了86.6%±0.5%。洗脱曲线如图7所示。

洗脱液pH、离子强度、流速三个因素对分离猪股骨降血压肽有不同程度的影响。离子强度过大或小都会导致分离不开，流速过大也使分离效果不佳，流速过小又会降低分离效率，本研究探索出的最佳的分离条件为猪股骨降血压肽产品的开发提供了一定实验基础。经离子交换分离的高活性组分的脱盐也是纯化的关键。传统的脱盐方法透析、纳滤等不适用小分子的脱盐，适用的电渗析脱盐又能源消耗大，回收率低。而凝胶层析脱盐操作简便，成本低，回收率高，脱盐效果好。

图3　不同离子强度的分离图谱Fig.3　The separation pattern of different ionic strength

国内外也有较多的学者利用离子交换层析研究不同蛋白源的降血压肽的分离纯化，如李世敏等［17］利用玉米蛋白酶解得到的酶解液，用离子交换层析进行初步分离，得到的组分中活性最高的ACE抑制率比酶解液的抑制率高出一倍。Leslie等［18］利用离子交换层析分离出高活性的苜蓿蛋白降血压肽，等等。降血压肽没有特定的功能基团，所以采用简单直接的分离方法无法分离出单体，采用膜分离技术、凝胶层析技术、离子交换层析等多种手段相结合，以使分离出单一的猪股骨降血压肽组分，促进猪股骨降血压肽的工业化生产。

3　结论

通过离子交换层析，分离到了活性较高猪股骨降血压肽，其IC50值为0.1012mg/mL，确定了最佳洗脱条件为：以pH=6.0磷酸盐缓冲液为A液，B液为含1mol/L NaCl的pH=6.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗脱流速为0.8mL/min。再经过脱盐后，分离出的猪股骨降血压肽活性提高到了0.0836mg/mL，脱盐率达到86.6%±0.5%，较刘小红等［7］用离子交换层析分离的降血压肽组分的ACE抑制活性提高了5.8倍。

图4　不同流速的分离图谱Fig.4　The separation pattern of different flow rates

图5　最佳洗脱曲线Fig.5　The best separation pattern of Antihypertensive Peptides

图6　各个组分的IC50值Fig.6　The IC50of each component

图7　组分1的脱盐洗脱曲线Fig.7　The separation pattern of peak 1 after desalination

［1］万顺刚.蛋黄ACE抑制肽分离纯化研究［J］.广西大学学报，2007（4）：6-12.

［2］Eriksen E K，Vegarud G E，Langsrud T，et al.Effect of milk proteins and their hydrolysates on in vitro immune responses［J］. Small Ruminant Research，2008，79（1）：29-37.

［3］Netsanet Shiferaw Terefe，Olga Glagovskaia，Kirthi De Silva，et al.Application of stimuli responsive polymers for sustainable ion exchange chromatography［J］.Food and Bioproducts Processing，2014，92（2）：208-225.

［4］Bertrand Guélat，Lydia Delegrange，Pascal Valax，et al.Modelbased prediction of monoclonal antibody retention in ion-exchange chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2013，1208（12）：17-25.

［5］Ion Exchange Chromatography.principles and methods［M］. Sweden：Pharmacia Fine Chemicals，2002：16-19.

［6］陈来同，徐德昌.生化工艺学［M］.北京：北京大学出版社，1997：63-66.

［7］刘小红，李诚，付刚，等.猪股骨头胶原蛋白降血压肽的分离纯化［J］.食品科学，2014，35（4）：50-55.

［8］Lieselot Vercruysse，Guy Smagghe，Toshiro Matsui，et al. Purification and identification of an angiotensin I converting enzyme（ACE） inhibitorypeptidefromthegastrointestinal hydrolysate of the cotton leafworm，Spodoptera littoralis［J］. Process Biochemistry，2008，43：900-904.

［9］KunioSuetsuna， Jiun-RongChen.Identificationof Antihypertensive Peptides from Peptic Digest of Two Microalgae，Chlorella vulgaris and Spirulina platensis［J］.Marine Biotechnology，2001（3）：305-309.

［10］喇文军，刘冬，张丽君，等.离子交换层析法分离纯化玉米降血压肽的研究［J］.食品工程，2007（3）：57-60.

［11］杨兆勇，王文礼，苏秀兰.天然产物中的多肽的分离、分析及其药用价值［J］.内蒙古医学院学报，2004，26（2）：137.

［12］李翠蓉.凝胶层析脱盐技术应用［J］.石河子科技，2009（6）：43-45.

［13］周存山，马海乐，余筱洁，等.麦胚蛋白降压肽的大孔树脂脱盐研究［J］.食品科学，2006，27（3）：142-146.

［14］GB/T12457-2008食品中氯化钠的测定［G］.

［15］Cushman D W，Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin I-converting enzyme of rabbit lung［J］.Biochem Pharmacol，1971（20）：1637-1648.

［16］SUN Weizheng，ZHAO Haifeng，ZHAO Qiangzhong，et al. Structural characteristics of peptides extracted from Cantonese sausageduringdryingandtheirantioxidantactivities［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（4）：558-563.

［17］李世敏，张丽君，刘冬，等.玉米降血压肽的分离纯化研究［J］.食品科学，2006（7）：69-72.

［18］Leslie Boudesocque，Romain Kapel，Cedric Paris，et al. Concentration and selective fractionation of an antihypertensive peptide from an alfalfa white proteins hydrolysate by mixed ionexchange centrifugal partition chromatography［J］.Journalof Chromatography B，2012，905：23-30.

Separation and purification of pig femoral collagen antihyper-tensive peptides by ion exchange chromatography

SHU Yi-mei，LI Cheng*，ZHENG Li-jun，PAN Shu-xuan，CHEN Na，GUO Wei，WANG Shi-yi，FU Gang
（College of Food，Sichuan Agriculture University，Ya’an 625014，China）

In order to obtain high activity and purity of antihypertensive peptides，the method of ion exchange chromatography was used to separat the solution afterthe preliminary separation and charactenization by ultrafiltration and gel permeation chromatography.The eluent pH，ionic strength，velocity of the three factors were studied.The optimal conditions for analysis were as follows：elution of pH=6.0，the flow rate was 0.8mL/min，the ionic strength was 1.0mol/L.The results showed that the fraction was then purified by ion exchange chromatography into 3 peaks，in which peak 1 had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50of 0.1012mg/mL.And the peak 1 was further desalinationted by gel permeation chromatography to obtain 4 peaks，and the peak 2 had the highest ACE-inhibitory activity with an IC50of 0.0836mg/mL，the desalination rate 86.60%±0.5%.

enzymolysis liquid；antihypertensive peptides；ion exchange chromatography；gel chromatography；half inhibitory concentration of ACE

TS251

B

1002-0306（2015）02-0253-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.046

2014－06－06

舒一梅（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：畜产品质量与安全。

李诚（1964-），男，硕士研究生，教授，研究方向：畜产品加工与质量安全控制。