不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中品质的动态变化

侯晓艳，陈安均，罗　惟，董　维，牛凯莉，彭易涛（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中品质的动态变化

侯晓艳，陈安均*，罗惟，董维，牛凯莉，彭易涛
（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

以白萝卜为主要原料，利用植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌进行纯种发酵，并以自然发酵萝卜为对照，对发酵过程中泡萝卜的总酸及氨基态氮、亚硝酸盐、脆度4个理化指标进行动态测定，同时利用顶空固相微萃取和气质联用方法对发酵成熟的泡萝卜的挥发性风味物质进行测定。结果表明，接种发酵可以明显的缩短发酵周期，提升产品品质。

乳酸菌，发酵，品质，动态变化

泡菜是指蔬菜在一定浓度的食盐溶液中，借助于天然附着在其表面的微生物或人工接种的乳酸菌等，利用蔬菜中的可发酵糖类等营养物质发酵产酸，同时利用食盐的高渗透压，共同抑制泡菜中其他有害微生物的生长，另外还伴随着乙醇发酵和醋酸发酵等一系列生化反应而形成的有特殊风味的发酵制品［1］。研究发现经常食用泡菜可达到防病治病、保健［2］和延年益寿［3］的功效。

20世纪60年代欧洲的C S Pederson和M N Aibury［4］率先将纯种发酵技术应用于泡菜研究。Choi等［5］从韩国泡菜中分离出梓檬色的明串珠菌，将其用于泡菜纯种发酵，可以获得品质良好的泡菜并能延长产品的货架期。叶淑红［6］利用从酸菜汁中分离出的植物乳杆菌发酵黄瓜泡菜，最短发酵周期只需要36h。赵历等［7］验证了植物乳杆菌纯种发酵甘薯泡菜的可行性，经过发酵条件的优化后，得到了色泽好、质地脆、口感佳、营养丰富的泡菜新产品。陆利霞等［8］以自行分离的植物乳杆菌B2进行单一菌株发酵剂接种制作萝卜泡菜，通过比较发酵周期、发酵酸度、pH、OD值等，各指标均优于自然发酵泡菜。

本研究通过对几种乳酸菌纯种发酵萝卜过程中的理化指标进行动态测定，进而揭示其品质变化规律，为泡菜工业化生产提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）来自本系微生物实验室；短乳杆菌（Lactobacillus brevis）SICC1.1161、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SICC1.521购于四川省微生物资源平台菌种保藏中心；新鲜白萝卜购于雅安市农贸市场；泡菜坛（4L） 购于雅安市农贸市场；基础培养基（MRS） 葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL。

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）美国Agilent公司；Supleco固相微萃取装置、65μm DVB/PDMS萃取头、1μL微量进样器美国SUPELCO公司；HHS-2S型电子恒温不锈钢水浴锅上海光地仪器设备有限公司；DZTW调温电热套北京市永光明医疗仪器厂；SHB-III型循环水多用真空泵菏泽市鑫源仪器仪表有限公司；同时蒸馏萃取装置北京玻璃仪器厂；RE-52-99旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；TA-XT-Plus质构仪英国Stable Micro System公司。

1.2实验方法

1.2.1菌种活化冻干菌种活化：用75%酒精棉擦拭装有菌种的安瓿管，在酒精灯火焰上烧热安瓿管封口处，并立即在安瓿管封口处滴一滴无菌水，使其前端炸开，用无菌吸管吸取0.3～0.4mL的无菌MRS液体培养基于安瓿管中，使冻干菌体充分溶解成为悬浮状液体。取0.2mL的菌悬液，转接到MRS液体培养基里，37℃培养18～24h，重复两次。

1.2.2发酵种子液的制备将活化好的冻干菌种转接于MRS液体培养基37℃培养24h；发酵种子液经离心（8000r/min，15min，4℃）后用生理盐水制成菌悬液备用。

1.2.3萝卜汁培养基的制备萝卜汁培养基：300mL萝卜汁（100g萝卜可得到100mL萝卜汁，10000r/min，10min，4℃），蛋白胨10g，葡萄糖20g，pH6.5～6.8，700mL蒸馏水。

1.2.4泡萝卜制作工艺流程［9］新鲜白萝卜→清洗→杀菌（紫外照射0.5h）→晾干→切分→称质量→加入无菌盐水（浓度为4%）→接种乳酸菌纯培养液（108CFU/mL）→入坛发酵（25℃）→泡菜成品。

1.2.5发酵终点的确定由于泡菜发酵终点的确定没有相应的国家标准可执行，因此本实验拟采用口感与酸度相结合的方法进行判定。当泡菜总酸含量在0.4%～0.6%范围时，萝卜生辣味消失、酸度适宜，质地脆嫩时，表明泡菜已经基本成熟［9］。

1.2.6单菌种发酵性能的测定在萝卜汁培养基中接种已经活化的各菌株并在37℃培养每隔8h取样测定其OD值。

按1.2.4所述工艺泡制萝卜，以未接种的自然发酵萝卜为对照，每天定时取样测定以下指标：

1.2.6.1脆度用质构仪测定；测试条件如下：力量感应元5kg，探头P/5，测前速率2mm/s，测试中速率2mm/s，测后速率10mm/s，压缩距离：5mm，数据采集率：500pps，触发力5g。

1.2.6.2总酸采用GB/T 12456《食品中总酸的测定》［10］的方法进行测定。

1.2.6.3亚硝酸盐含量采用GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》［11］的方法进行测定。1.2.6.4氨基态氮采用甲醛滴定法［12］测定。

1.2.6.5挥发性风味物质采用固相微萃取技术及气质联用（SPME/GC-MS）对发酵成熟的泡萝卜进行挥发性风味成分的检测。

1.2.7挥发性风味成分的检测SPME顶空微萃取操作方法：将发酵成熟的萝卜匀浆并取5.000g样品置于15mL样品瓶中，置于43℃的恒温水浴锅中平衡30min，然后将SPME手动进样柄的针头插入进样瓶中，伸出纤维于上空的气体中萃取30min，缩回纤维，并迅速将萃取头插入气相色谱仪进样口，伸出纤维头解析5min后缩回，取出萃取头，进行分析［13］。

色谱条件：色谱柱为 HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱；程序升温：柱箱初始温度36℃，保持3min，以5℃/min升至65℃，保持1min，以3℃/min升至108℃，保持1min，以2℃/min升至110℃，保持1min，以3℃/min升至155℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，保持3min；不分流进样；载气He，流量1.2mL/min；进样口温度250℃；辅助加热器温度280℃。

质谱条件：电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，质量扫描范围：m/z 50～550amu。

定性定量分析：由GC-MS得到的图谱，经计算机在NIST.11谱库检索，仅报道匹配度大于80的鉴定结果，并采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。

2　结果与分析

2.1不同乳酸菌在萝卜汁培养基中的OD值变化情况

图1显示了4种乳酸菌在萝卜汁培养基中OD值的变化情况。显然，植物乳杆菌的生长速度明显高于其他3种菌体，短乳杆菌次之，肠膜明串珠菌和戊糖片球菌相当。

图1　不同乳酸菌在萝卜汁培养基中OD值变化曲线Fig.1　Dynamic change of OD value by different lactic acid bacteria

2.2不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中总酸含量的动态变化

图2显示了分别接种肠膜明串珠菌、短乳杆菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌发酵萝卜以及自然发酵萝卜过程中总酸含量的动态变化。总的来说，自然发酵和接种乳酸菌发酵萝卜总酸含量均是逐渐增多，并且发酵前期的增加速度高于后期。从产酸总量来说，植物乳杆菌产酸量最大，其次是短乳杆菌，然后是戊糖片球菌和肠膜明串珠菌，自然发酵产酸量最低，可见接种发酵能够加快发酵速度缩短发酵周期，这一点对于工业化生产十分有利。

2.3不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中氨基态氮的动态变化

图3显示了不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中氨基态氮含量的动态变化。随着发酵的进行氨基态氮的含量在不断的下降。这可能的原因是萝卜中的肽、氨基酸等在发酵过程中不断的溶入到泡菜汁中被各种微生物利用。

图2　不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中总酸含量的动态变化Fig.2　Dynamic change of total acid by different lactic acid bacteria

图3　不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中氨基态氮含量的动态变化Fig.3　Dynamic change of amino nitrogen content by different lactic acid bacteria

2.4不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中亚硝酸盐含量的动态变化

泡菜在发酵过程中，蔬菜本身的硝酸盐被硝酸还原酶还原成亚硝酸盐。人体摄入亚硝酸盐后，亚硝酸与胃中的含氮化合物结合成具有致癌性的亚硝胺［14］，对人体健康造成极大危害。

图4　不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中亚硝酸盐含量的动态变化Fig.4　Dynamic change of nitrite content by different lactic acid bacteria

从图4可知，接种4种乳酸菌发酵过程中均没有出现明显的亚硝峰，而自然发酵在第3d出现亚硝峰，最高含量达30.459mg/kg，之后逐渐下降，至第7d时，接种发酵的萝卜泡菜中亚硝酸盐含量均低于自然发酵。由此可见，接种发酵可以有效降低泡菜中亚硝酸盐含量，保证了泡菜的食用安全性。

图5　不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中脆度的动态变化Fig.5　Dynamic change of brittleness by different lactic acid bacteria

2.5不同乳酸菌纯种发酵萝卜过程中脆度的动态变化

脆度值是质构仪模仿人咀嚼萝卜时，萝卜断裂时需要的力的大小［15］。力越大说明萝卜越脆。由图5可知，自然发酵和接种发酵过程中脆度变化是一致的，均是随着发酵的进行萝卜脆度逐渐减小。发酵成熟时（总酸含量达到0.5%）脆度大小依次为：短乳杆菌＞肠膜明串珠菌＞植物乳杆菌＞戊糖片球菌＞自然发酵，由此可见接种发酵的萝卜脆度优于自然发酵，这与汪立平等［16］的研究结果一致。

2.6不同乳酸菌纯种发酵萝卜挥发性风味物质的比较

运用SPME-GC/MS对酸度达到0.5%［17］（以乳酸计）的植物乳杆菌发酵萝卜、短乳杆菌发酵萝卜、肠膜明串珠菌发酵萝卜、戊糖片球菌发酵萝卜的挥发性风味物质进行检测，结果如表1所示。检测出5种泡萝卜成品中挥发性风味物质达51种，在顶空温度43℃条件下，烯类、酯类、酮类是泡萝卜中含量较多的挥发性成分。一般来说，泡菜中的风味物质主要有两大来源，一是泡菜原料（蔬菜和香辛料）本身的风味物质，二是乳酸菌及其他微生物发酵产生的风味物质。

据陈功等［17］的研究表明，醇类和酯类风味阈值较大，故其对泡菜的风味影响较小，而二甲基硫化物、烯类、醛类由于阈值较小，即使含量很少对泡菜的风味也有很大的影响。

此外，由表1可以看出，自然发酵萝卜产生的风味物质较多但是含量都比较低，主要是因为自然发酵过程中微生物菌系比较丰富，产生了多种多样的中间代谢产物，利于多种物质的合成。自然发酵萝卜中罗勒烯、萜品油烯、沉香醇等蔬菜本身所带的挥发性物质，相比于接种发酵萝卜中此类物质，含量大大减少，其原因可能是自然发酵需要较长的时间才能达到所需要的酸度（0.5%），较长的发酵周期使得蔬菜本身的挥发性物质减少甚至消失，由此可见，接种发酵能够明显地缩短发酵周期，从而有效的保存蔬菜本身的香气成分。

3　结论

对4种乳酸菌（植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌）发酵萝卜以及自然发酵萝卜过程进行动态监测，由测得数据分析可知，发酵过程中总酸含量呈不断上升的趋势，第6、7d趋于平缓，产酸速率最大的为植物乳杆菌，其次是短乳杆菌，肠膜明串珠菌和戊糖片球菌相当，自然发酵产酸速率最小；发酵过程中氨基态氮、脆度均呈下降趋势，且发酵成熟时脆度大小依次为：短乳杆菌＞肠膜明串珠菌＞植物乳杆菌＞戊糖片球菌＞自然发酵；整个发酵过程中，只有自然发酵萝卜中亚硝酸盐含量在第3d出现亚硝峰，接种发酵均未出现亚硝峰；泡萝卜中挥发性风味物质主要是烯类、酯类和酮类，自然发酵萝卜产生的风味物质相比接种发酵稍多，但是由于自然发酵周期较长，蔬菜本身的一些对风味影响较大的挥发性物质含量大大减少，由此可见，接种发酵可以大大缩短发酵周期，最大程度的保持蔬菜原有的风味成分。

表1　不同乳酸菌发酵萝卜主要挥发性成分及相对含量Table 1　Main volatile composition and relative content by different lactic acid bacteria

续表

［1］何淑玲，李博，籍保平.泡菜中亚硝酸盐问题的研究进展［J］.食品与发酵工业，2009，31（11）：85-87.

［2］李书华，蒲彪，陈封政.泡菜的功能及防腐研究进展［J］.中国酿造，2005（4）：6-8.

［3］Heui D.Antimutagenic activity of lactobacillus plantarum KLAB21 is isolated from kimchi Korean fermented vegetables［J］. Biotechnology Letters，2001，23（19）：1583-1589.

［4］PERDERSON S C.The effect of pure culture inoculation on fermentation of cucumbers［J］.Food Technology，1961，15：351-354.

［5］Choi I K，Jung S H，Kim B J，et al.Novel Leuconostoc citreum starter culture system for the fermentation of kimchi，a fermented cabbage product［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2003，84（4）：247-253.

［6］叶淑红.植物乳杆菌的筛选及其在泡菜中的应用［J］.中国酿造，2004（7）：19-21.

［7］赵历.植物乳杆菌发酵甘薯泡菜的研究［J］.安徽农业科学，2010（14）：7516-7517，7524.

［8］陆利霞，王晓飞，熊晓辉，等.植物乳杆菌b2纯种发酵萝卜泡菜的研究［J］.食品工业科技，2005，26（7）：59-61.

［9］敖晓琳.四川泡菜中两株优良乳酸菌的鉴定及不同发酵条件对其发酵泡菜品质的影响［J］．食品科学，2011，32（11）：152-156．

［10］GB/T 12456-2008食品中总酸的测定［S］.

［11］GB 5009.33-2010食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定［S］.

［12］杨瑞，李博，籍保平.泡菜中亚硝酸盐问题的研究进展［J］.食品与发酵工业，2009，31（11）：85-87.

［13］张金凤，蒲彪，陈安均.SDE和HS-SPME结合GC-MS分析传统四川泡萝卜的挥发性成分［J］.食品工业科技，2014，35（15）：297-303.

［14］张少颖.不同处理方法对泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的影响［J］.中国食品学报，2011，11（1）：132-134.

［15］乐毅，刘学文.白萝卜泡菜保脆工艺研究［J］.食品与发酵科技，2011，47（2）：78-80.

［16］汪立平，汪欣，艾连中.纯种植物乳杆菌发酵低盐萝卜泡菜的研究［J］.食品科学，2013，34（17）：182-186.

［17］陈功，张其圣，余文华，等.四川泡菜挥发性成分及主体风味的研究（二）［J］.中国酿造，2012，12：21-23

Dynamic changes of quality of pickles fermented by different lactic acid bacteria

HOU Xiao-yan，CHEN An-jun*，LUO Wei，DONG Wei，NIU Kai-li，PENG Yi-tao
（College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Using carrots as the main material to preserve pickles by Lactobacillus plantarum，Lactobacillus brevis，Leuconostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus，at the same time，the natural fermentation radish for comparison.Total acid and amino nitrogen，nitrite，brittleness four physical and chemical indicators were determined and the volatile flavor substances were determined by solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-CC/MS）.The results showed that the breed fermentation could significantly shorten the fermentation period and improve product quality.

lactic acid bacteria；fermentation；quality；dynamic changes

TS255.54

A

1002-0306（2015）02-0181-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.030

2014－05－22

侯晓艳（1990-），女，在读硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。

陈安均（1970-），男，博士，副教授，研究方向：园艺产品加工与贮藏。

国家自然科学基金项目（31171726）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD31B04）。