sAPRIL结合肽对LOVO细胞5-FU化疗敏感性的影响

何小庆　柳　芳　许　雯　何美蓉

sAPRIL结合肽对LOVO细胞5-FU化疗敏感性的影响

何小庆1柳芳2许雯2何美蓉2

目的增殖诱导配体（APRIL）与结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐药性密切相关。我们前期已利用噬菌体随机肽库技术成功筛选并人工合成与sAPRIL有高亲和力的结合肽。本研究旨在探讨sAPRIL结合肽对结直肠癌LOVO细胞5-FU化疗敏感性的影响。方法将LOVO细胞分为PBS组、5-FU组、sAPRIL结合肽+5-FU组。采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞仪测定细胞周期及细胞凋亡。结果5-FU组和sAPRIL结合肽+5-FU组增殖抑制率分别为（37.62±7.07）%、（63.05±2.15）%；流式细胞仪检测各组的细胞周期显示5-FU组阻滞在S期，sAPRIL结合肽+5-FU组阻滞在G0/G1期和S期，且S期阻滞效应显著强于5-FU组；三组细胞凋亡率分别为（0.21±0.09）%、（12.80±0.30）%、（17.1± 0.66）%。结论sAPRIL结合肽能增强结直肠癌LOVO细胞对5-FU的化疗敏感性，有望成为结直肠癌靶向治疗的新型候选制剂。

结直肠癌；增殖诱导配体；5-氟尿嘧啶；细胞增殖；细胞凋亡

增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）是TNF超家族的一个新成员，在正常组织中表达很弱，但在包括结直肠癌在内的多种肿瘤组织中过表达［1］。本课题组前期研究发现APRIL过表达与结直肠癌生长、转移及对5-FU耐药性密切相关［2］。因而，设法降低APRIL的生物活性则有望抑制大肠癌细胞的增殖，延缓肿瘤的转移并提高其对5-FU的化疗敏感性。近年来，分子靶向治疗的出现，为治疗肿瘤提供了强有力的手段。在前期研究中，我们通过噬菌体随机肽库技术筛选和鉴定出高亲和力的sAPRIL结合肽，其氨基酸序列为AAAPLAQHMA。本研究旨在探讨sAPRIL结合肽对结直肠癌LOVO细胞的5-FU化疗敏感性的影响。

材料与方法

一、材料和试剂

1.实验材料

人结直肠癌LOVO细胞株为本实验室传代保存。

2.主要试剂

5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业公司）；sAPRIL结合肽（杭州中肽生物技术公司）；RPMI 1640培养基（Gibcol公司）；CCK-8试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

二、实验方法

1.CCK-8法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的LOVO细胞，调整细胞浓度为2×104/mL，每孔100滋L RPMI 1640完全培养基含2×103个细胞接种于96孔板，每组设5个复孔；第2日每组分别PBS、5-FU、（sAPRIL结合肽+5-FU）处理48 h之后，加入CCK-8试剂10滋L/孔孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度（A）值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：抑制率=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。

2.流式细胞仪检测细胞周期

(二)张慧剑《明清江苏文人年表》、江庆柏《清代人物生卒年表》均依据《历代名人生卒年表补》谓金门诏“生于康熙十一年，卒于乾隆十六年”。如前所言，《表补》将生年定为“康熙十二年”而非“康熙十一年”，张、江均引用有误，且《表补》卒年考订本误。

收集各组不同处理后的LOVO细胞1×106/个，用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，4℃固定过夜后离心弃掉上清，用PBS洗细胞1次，加入碘化丙啶染色液重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30 min后进行流式细胞仪检测。

3.流式细胞仪检测细胞凋亡

收集各组不同处理后的LOVO细胞1×106/个，用PBS洗涤2次，离心弃掉上清，加入195滋L Annexin V-FITC（20～25℃）结合液轻轻重悬细胞，再加入5滋L Annexin V-FITC室温避光孵育10 min。离心弃上清，加入190滋L Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，再加入10滋L碘化丙啶染色液混匀后随即进行流式细胞仪检测。

三、统计学分析

实验数据以x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件分析数据。多组间差异采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、sAPRIL结合肽对细胞增殖抑制率的影响

二、sAPRIL结合肽对细胞周期分布的影响

采用流式细胞仪检测细胞周期，与PBS组相比，5-FU组细胞周期阻滞在S期，sAPRIL结合肽+ 5-FU组细胞阻滞在G0/G1和S期，且S期阻滞效应比5-FU组更明显（P＜0.05），见图1。

三、sAPRIL结合肽对细胞凋亡率的影响

采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率，PBS组、5-FU组、（sAPRIL结合肽+5-FU）组细胞凋亡率分别为（0.21±0.09）%、（12.80±0.30）%、（17.1±0.66）%。（sAPRIL结合肽+5-FU）组的凋亡率显著高于另外两组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

讨论

结直肠癌是常见的消化系统肿瘤之一，全球结直肠癌发病率和病死率均位于所有恶性肿瘤的第3位［3］。5-FU作为单药或联合用药至今仍是结直肠癌患者的一线治疗药物，但因患者易对其产生耐药及副作用大，总体有效率较低。因此，如何提高5-FU化疗敏感性、逆转耐药一直是临床面临解决的重要问题［4］。

APRIL是肿瘤坏死因子超家族的一个新成员，其通过与特异性受体结合，参与促进多种肿瘤细胞增殖及加速肿瘤形成等多个过程［5］。本课题组前期研究发现，APRIL过表达与结直肠癌生长、转移及对5-FU耐药性密切相关。鉴于多肽类制剂具有合成和纯化操作简便、免疫原性低、渗透力强等诸多优点［6-8］，因此，寻找特异性sAPRIL结合肽，以之阻断APRIL与其受体结合，通过抑制APRIL的生物活性，提高5-FU对结直肠癌的化疗敏感性是本研究的主要内容。

肿瘤的形成是由于细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡发生了破坏，因此，抑制细胞增殖或者诱导细胞凋亡成为治疗肿瘤的最根本的途径［9-10］。本研究表明，（sAPRIL结合肽+5-FU）组的细胞增殖抑制率及细胞周期S期阻滞效应显著高于单药5-FU组；另外，（sAPRIL结合肽+5-FU）组诱导早期细胞凋亡率也明显高于单药5-FU组。

图1　流式细胞仪检测细胞周期

图2　流式细胞仪检测细胞凋亡

本研究已经从抑制结直肠癌LOVO细胞增殖及诱导LOVO细胞凋亡两方面验证sAPRIL结合肽可提高5-FU对LOVO细胞的化疗敏感性。在后期的实验中，我们将检测细胞周期蛋白及细胞凋亡蛋白等相关蛋白的表达情况，进一步阐明sAPRIL结合肽提高结直肠癌对5-FU化疗敏感性的分子机制。sAPRIL结合肽有望成为APRIL过表达结直肠癌的靶向治疗的新型候选制剂。

1Moreaux J，Veyrune J L，De Vos J，et al.APRIL is overexpressed in cancer：link with tumor progression.BMC Cancer，2009，9：83.

2关婧，孙爱民，王莉慧，等.慢病毒介导RNAi抑制大肠癌细胞APRIL表达对化疗敏感性的影响.南方医科大学学报，2011，31（9）：1600-1604.

3Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

4Zhang N，Yin Y，Xu SJ，et al.5-Fluorouracil：mechanisms of resistance and reversal strategies.Molecules，2008，13（8）：1551-1569.

5Petty RD，Samuel LM，Murray GI，et al.APRIL is a novel clinical chemo-resistance biomarker in colorectal adenocarcinoma identified by gene expression profiling.BMC Cancer，2009，9：434.

6Li ZJ，Cho CH.Peptides as targeting probes against tumor vasculature for diagnosis and drug delivery.J Transl Med，2012，10（Suppl 1）：S1.

7Vessillier S，Adams G，Montero-Melendez T，et al.Molecular engineering of short half-life small peptides（VIP，MSH and 3MSH）fused to latency-associated peptide results in improved anti-inflammatory therapeutics.Ann Rheum Dis，2011，71（1）：143-149.

8Borghouts C，Kunz C，Groner B.Current strategies for the development of peptide-based anti-cancer therapeutics.J Pept Sci，2005，11（11）：713-726.

9Mason EF，Rathmell JC.Cell metabolism：an essential link between cell growth and apoptosis.Biochim Biophys Acta，2011，1813（4）：645-654.

10 Gomes CC，Duarte AP，Diniz MG，et al.Review article：Current concepts of ameloblastoma pathogenesis.J Oral Pathol Med，2010，39（8）：585-591.

A proliferation-inducing ligand-binding peptide improves chemo-sensitivity of 5-FU on colorectal LO－VO cells

HE Xiao-qing1，LIU Fang2，XU Wen2，HE Mei-rong2.
1）The First Department of Chemotheraphy，Wuzhou Red Cross Hospital，Guangxi Zhuang Autonomous Region，543002；
2）Department of Gastroenterology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515

Objective This study aimed to verify if the sAPRIL-binding peptide can enhance chemosensitivity of 5-FU on colorectal cancer cells.Methods LOVO cells were divided into three groups：PBS，5-FU，and sAPRIL-binding peptide plus 5-FU.The cell growth inhibition rate was detected by CCK-8 assay，and the cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry.Results The cell growth inhibition rate was（0±0）%in PBS group，（37.62±7.07）%in 5-FUgroup，（63.05±2.15）%in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，respectively.In 5-FU group，cell cycle was arrested at S phase；and in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，cell cycle was arrested at both G0/G1 and S phases（more markedly at S phase compared with 5-FU alone）.The percentage of early apoptotic cells was（0.21±0.09）%in PBS group，（12.80±0.30）%in 5-FUgroup，and（17.1±0.66）%in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，respectively.Conclusions The sAPRIL-binding peptide can enhance chemo-sensitivity of 5-FU on colorectal cancer LOVO cells.This peptide might be a new approach for molecular targeted therapy of colorectal cancer.

Colorectal cancer；A proliferation-inducing ligand；5-fluorouracil；Cell proliferation；Cell apoptosis

2014-12-08）

（本文编辑：肖冰）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.006

1 543002梧州市红十字会医院化疗科一区；2 510515南方医科大学南方医院消化内科

何美蓉，E-mail：hemr@263.net