乳腺癌超声征象与Ki67、p53表达的相关性及临床意义

李 宏，李德华，胡 波

（1.辽宁医学院，辽宁 锦州 121000；2.抚顺市第四医院，辽宁 抚顺 113000）

乳腺癌以23%的女性恶性肿瘤占有率成为近年来恶性肿瘤增长幅度最大的肿瘤，且呈年轻化趋势[1]。乳腺彩色多普勒超声检查是乳腺癌早期发现、早期诊断的基础方法。随着分子生物学技术的发展，人们发现乳腺癌的发生、发展和预后与多种基因蛋白的突变和异常表达相关。Ki67、p53等生物学指标在乳腺癌病情发展、治疗和预后的判断有重要的临床价值。

国内外文献报道，Ki67是核增殖相关蛋白，能有效评估肿瘤细胞增殖活性[2-3]。Ki67的表达是乳腺癌研究的重要指标，其表达的高低反映肿瘤细胞的增殖情况，与乳腺癌的发生、发展、转移等方面显著相关[4-5]。p53是肿瘤中最易发生突变的抑癌基因，分野生型和突变型。野生型p53通过提高DNA修复能力抑制细胞增殖及分化。突变型失去正常抑癌作用，促进细胞恶性转化而诱发肿瘤。研究表明，p53在正常乳腺组织不表达，而在乳腺癌组织中过度表达，p53是乳腺癌分期、分级和病理分型的独立预测指标[6]。目前，临床主要通过术后组织活检标本的免疫组化染色来判定Ki67、p53的表达，本文旨在通过术前的非侵袭性超声影像学方法预测及评估Ki67、p53的表达，进而分析超声征象与Ki67、p53表达的相关性，为乳腺癌非手术治疗、术前及术后风险评估提供指导依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集辽宁省抚顺市第四医院2013年12月—2014年6月保存的乳腺癌患者术后标本135例，均经病理检查确诊，资料完整。患者均为女性，年龄23～78 岁，平均年龄（45.28±8.71）岁，中位年龄 46岁。所有病例术前均行彩色多普勒超声检查，未行放疗、化疗及内分泌治疗。术后对肿瘤标本进行Ki67、p53免疫组化指标检测。

1.2 仪器及方法

应用美国GE公司Logiq P6彩色多普勒超声诊断仪，探头为11L。检查时患者仰卧，使用高频探头经体表直接检查，首先检查乳腺，最后检查腋窝，观察有无肿大淋巴结及其形态改变、血流情况。发现肿块时记录其声像图特征，重点记录肿块大小、边缘、形态，钙化的分布、形态，肿块边界是否清晰、周边血流分布及有无淋巴结转移情况。彩色血流显像分级按Adler血流分级法，为0～1级和2～3级。

1.3 主要试剂

兔抗人Ki67单克隆抗体SP6，兔抗人p53单克隆抗体SP5，柠檬酸盐抗原修复液（pH=6.0），Elivison二步法免疫组化检测试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。其余试剂均由辽宁医学院科研实验中心提供。

1.4 免疫组织化学方法

采用免疫组化方法检测组织Ki67、p53的表达。组织标本用10%福尔马林固定24 h，常规石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片，60℃烤片3 h。免疫组化染色：①石蜡切片常规二甲苯脱蜡。②对组织抗原进行高压热修复（220℃，2 min）：柠檬酸抗原修复液（0.01 M，pH6.0）。③3%H2O2室温下孵育 10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗3次（5 min/次）。④滴加一抗：Ki67、p53均采用即用型工作液。室温孵育60 min，PBS冲洗3次（5 min/次）。⑤滴加试剂：滴加聚合物增强剂（试剂A），孵育20 min，PBS冲洗后滴加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（试剂B），孵育30 min。⑥滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察显色满意后终止反应。⑦蒸馏水冲洗，苏木素复染3～5 min，1%盐酸酒精分化5 s，流水冲洗30 min。⑧梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。每次以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.5 判定标准

随机选取10个高倍视野，计数每个视野中的阳性细胞，并取平均值。Ki67、p53的表达以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性染色。根据切片所选视野中阳性细胞占全部细胞的比例将其分为：阳性＜10%为阴性（-），10%～25%为（+），26%～50%为（++），≥51%为（+++）。

1.6 数据统计

应用统计学软件SPSS 17.0进行统计分析，运用χ2检验和Spearman秩相关检验。分析结果以差异P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 超声征象特征

超声影像显示：135例患者中，42例肿块＜2 cm，93例肿块≥2 cm；78例肿块边缘有毛刺；50例肿块呈不规则形，36例呈分叶状，49例呈类圆形。107例患者钙化，36例散在分布，44例簇状分布，27例沿导管走向；钙化形态以细沙状为主，占53例；血流显像分级以2～3级为主，占102例；63例淋巴结转移；41例侵犯周围组织，见图1。

2.2 Ki67、p53在乳腺癌中的表达

在135例乳腺癌组织中，Ki67有87例表达阳性，阳性率64.4%（87/135），p53有69例表达阳性，阳性率 51.1%（69/135），见图2，3。

2.3 Ki67、p53的表达与超声征象的关系

图1 彩色多普勒超声征象。图1a：59岁，乳房肿瘤4.5 cm×2.6 cm，形态不规则。图1b：40岁，乳房肿瘤形态不规则，内伴多发钙化。图1c：59岁，乳房肿瘤形态不规则，血流信号丰富。图1d：56岁，腋下淋巴结转移。Figure 1. Color Doppler ultrasonography.Figure 1a:59 years old,breast tumor by 4.5 cm×2.6 cm with an irregular shape.Figure 1b:40 years old,breast tumor with an irregular shape and multiple calcification.Figure 1c:59 years old,breast tumor with an irregular shape and rich blood flow signal.Figure 1d:56 years old,with axillary lymph node metastasis.

图2 乳腺癌组织中 Ki67 的表达。图2a：阴性（-）；图2b～2d：Ki67 阳性表达于细胞核，图2b：（+），图2c：（++），图2d：（+++）。Figure 2. The expression of Ki67 in breast cancer.Figure 2a:negative(-);Figure 2b～2d:Positive expression of Ki67 in the nucleus,Figure 2b:(+),Figure 2c:(++),Figure 2d:(+++).

图3 乳腺癌组织中 p53 的表达。图3a：阴性（-）；图3b～3d：p53 阳性表达于细胞核，图3b：（+），图3c：（++），图3d：（+++）。Figure 3. The expression of p53 in breast cancer.Figure 3a:negative(-);Figure 3b～3d:Positive expression of p53 in the nucleus,Figure 3b:(+),Figure 3c:(++),Figure 3d:(+++).

Ki67、p53表达与血流显像分级，淋巴结转移及侵犯周围组织有显著性相关（P＜0.05），可见 Ki67、p53表达水平增高，血流显像分级越高，淋巴结转移机会越大，侵犯周围组织的可能性也越大。Ki67与肿块形态、钙化形态有显著相关性（P＜0.05），与钙化分布无相关性（P＞0.05），而p53与肿块形态、钙化形态无相关性（P＞0.05），与钙化分布有显著性相关（P＜0.05），可见 Ki67、p53在肿块形态、钙化分布、钙化形态方面表达的相关性上有差异。Ki67、p53表达与肿块大小、肿块边缘无相关性（P＞0.05）。见表1。

表1 乳腺癌Ki67、p53表达与超声征象的关系

2.3 Ki67表达与p53表达的关系

Ki67与p53表达程度呈正相关（r=0.617，P＜0.05），见表2。

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其发生、发展和转移是由多基因、多因素突变的结果。在乳腺组织癌变的进程中，相关基因Ki67、p53表达的改变从不同层面反映了乳腺癌的恶性程度及组织病理学改变，从而形成了多种影像学表现。Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，反映早期乳腺癌细胞增殖状态，其表达率增高，提示乳腺癌细胞的恶性程度大，肿瘤生长速度快，侵袭力强，发生转移较早，预后差，是指导乳腺癌早期诊断及评价预后的理想指标[7]。Sasano[7]研究表明Ki67表达水平反映肿瘤细胞的活性，与恶性肿瘤的发生、发展及预后显著相关。p53分野生型和突变型，突变型p53几乎表达于所有的恶性肿瘤中，乳腺癌中有20%～60%p53基因发生突变。p53过度表达或突变会增加乳腺正常组织及良性病变向乳腺癌发展的风险。Kobayashi等[8]研究报道，p53细胞增殖指数和突变率低，应与Ki67联检来区分乳腺癌类型。本实验通过对乳腺癌患者联检Ki67、p53组织病理学形态改变，分析其与乳腺癌超声影像征象之间存在的关联性。

表2 乳腺癌组织中Ki67、p53表达的关系

本实验结果显示，Ki67阳性率64.4%，p53阳性率51.1%。彩色多普勒超声显示Ki67、p53表达与肿块大小、肿块边缘无相关性。Ki67、p53的表达在血流显像分级（2～3级），淋巴结转移阳性及侵犯周围组织的病例中较血流显像分级（0～1级），淋巴结转移阴性及肿瘤未侵犯周围组织的病例明显增高，差异均具有统计学意义。超声显像提示血流显像分级越高，血流越丰富，淋巴结转移机会越多，侵犯周围组织的可能性也越大，此结果表明Ki67、p53的阳性表达与血流显像分级，淋巴结转移及侵犯周围组织呈显著性相关，这与Ki67、p53高表达水平可提示肿瘤恶性程度较高相一致。de Azambuja等[9]对文献进行Meta分析，发现早期乳腺癌淋巴结转移者Ki67高表达比例增加，预后差，提示Ki67可促进肿瘤转移并造成不良预后。Vincent-Salomon等[10]，Kerlikowske等[11]研究结果显示在乳腺原位癌、乳腺浸润性导管癌中Ki67和p53高表达，可作为乳腺癌浸润、转移及预后复发的高风险生物标志物。本研究显示Ki67与肿块形态、钙化形态显著性相关，与钙化分布无相关性，类圆形肿块Ki67的阳性表达率（79.6%）高于不规则形（62.0%）和分叶状（47.2%），杆状钙化Ki67的阳性表达率（81.8%）显著高于细沙状钙化（67.9%）和颗粒状钙化（47.6%），由此推断超声表现为类圆形肿块及杆状钙化的乳腺癌，其组织结构紊乱，增殖指数及恶性程度高，预后较差。而p53与肿块形态、钙化形态无相关性，与钙化分布有显著性相关，p53的阳性表达率在沿导管走向的钙化分布（74.1%）明显高于散在分布（41.7%）和簇状分布（52.3%），提示超声表现为钙化沿导管走向的乳腺癌组织坏死越明显，越容易导致钙化，其恶性程度越高。可见Ki67、p53在肿块形态、钙化分布、钙化形态方面表达的相关性上存在差异，但未见相关文献报道，还需进一步研究予以证实。Ki67与p53表达呈正相关，说明两者在肿瘤生长进程中起相互协同和调节的作用。在乳腺癌的研究中，Ki67与p53联检可以相互补充、相互印证，较充分的评估乳腺癌的恶性程度及预后效果。

综上所述，超声征象能清楚显示乳腺癌的形态学改变，是乳腺癌早期检查的可靠方法。而Ki67、p53表达能从组织学方面反映乳腺癌的生物学变化。乳腺癌超声征象与Ki67、p53表达之间具有一定的内在关联。超声征象从一定程度上体现Ki67、p53的表达情况，可作为预测乳腺癌患者Ki67、p53表达水平的无创性手段，进而为乳腺癌非手术治疗、术前诊断及预后评估提供指导依据。

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