白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸定量比较

李转梅，　张学兰，　李慧芬，　张群群

（山东中医药大学，山东　济南　250355）

白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸定量比较

李转梅，张学兰*，李慧芬，张群群

（山东中医药大学，山东济南250355）

目的 定量比较白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸。方法 采用甲醇回流-乙酸乙酯萃取法提取总银杏酸，用HPLC法测定白果不同部位（中种皮、内种皮、胚乳、胚）及不同炮制品（全白果、白果仁、去皮白果仁、炒白果仁、蒸白果仁、煮白果仁）中白果酸和总银杏酸。结果 白果的被测部位均含有白果酸、白果新酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸和十七烷一烯银杏酸，白果酸和总银杏酸的含有量顺序为：胚＞内种皮＞中种皮＞胚乳。白果不同炮制品中白果酸和总银杏酸含有量顺序为：全白果＞白果仁＞去皮白果仁＞煮白果仁＞炒白果仁、蒸白果仁。结论 通过去皮及加热炒、蒸、煮制可明显降低白果中白果酸和总银杏酸的量。

白果；不同部位；炮制；白果酸；总银杏酸

白果系我国特产药材，药食兼用，具有敛肺定喘，止带缩尿功能［1］。研究表明，白果具有抗疲劳及延缓衰老的作用［2］，白果清蛋白为其抑菌、抗肿瘤、抗衰老及免疫调节作用的有效成分［3-6］。但白果有毒，生食或食用加热不透的白果达到一定量时，可产生毒性反应，临床表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、烦躁不安、昏迷、抽搐、呼吸困难、乃致死亡，种仁与皮肤接触可引起皮肤局部红肿发痒［7］，即使煮熟的白果也不能过多食用。研究显示，银杏酚酸类成分具有致敏性、细胞毒性和免疫毒性［8］，为白果的主要毒性成分，也是银杏提取物及其制剂中的主要毒性物质。目前国际上要求银杏提取物中银杏酸含有量应控制在5μg/g以下［9］。白果经炮制后可降低毒性，供药用和食用。古今对白果的炮制方法主要有去壳、去皮心、蒸制、火煨，炒黄、煮熟等，《中国药典》2010年版收载白果仁和炒白果仁两种饮片规格，《全国中药炮制规范》1988年版还收载蒸白果仁［10］，《中国药典》2010年版规定，银杏叶提取物中总银杏酸不得超过10μg/g［1］，但对白果药材及其饮片中银杏酸的限量未作规定。采用固相萃取-HPLC法测定不同产地白果药材中总银杏酸，结果为67.9～393.6 μg/g，远远超出了安全范围［11］。用HPLC法测定大佛指银杏中银杏酚酸，结果以胚芽中含有量最高［12］。对白果不同部位中的氰氢化物进行了定性和定量检测，结果表明白果中不含氰化物［13］。陈文英等测定了白果中总黄酮量［14］。但炮制对白果中银杏酸的影响未见报道，目前白果炮制减毒机理及炮制减毒技术研究尚属空白，从而限制了白果的应用、新产品的开发及出口创汇。本研究采用HPLC法定量测定白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸，为白果饮片的炮制及研制安全有效的白果产品提供科学依据。

1　仪器与试药

日立L-2000型高效液相色谱仪（含DAD检测器，日本日立公司）；FA1604N型电子天平（十万分之一，上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；PM PLUS型红外测温仪（美国Raytek公司）；多星电炒锅（淄博多星电器集团有限责任公司）。

白果酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度≥98%，批号111762-200601）；总银杏酸对照品（白果酸、白果新酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸）中国药品生物制品检定所，供鉴别用，批号111594-200603）；HPLC用甲醇（色谱纯）；娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

碳酸钠-盐酸缓冲溶液：精密称取无水碳酸钠12.5 g溶解于250 mL蒸馏水中，滴加盐酸溶液调pH至2.5。

白果药材采集自济南市长清区五峰山，经山东中医药大学中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的成熟种子。取鲜白果，除去杂质，50℃烘干。

2　方法与结果

2.1样品的制备 取净白果，手工分离其硬壳（中种皮）、膜质内种皮、胚乳和胚，得中种皮、内种皮、胚乳、胚，共4个不同部位。全白果：取白果药材，除去杂质。白果仁：取全白果，除去中种皮。去皮白果仁：取全白果，除去中种皮和内种皮。炒白果仁：取去皮白果仁100 g，置热锅内，200℃炒至表面深黄色，有裂纹，具香气。蒸白果仁：取净白果仁100 g，置笼屉内，隔水蒸制4 h，取出，50℃烘干。煮白果仁：取净白果仁100 g，置锅内，加适量的水煮制4 h，取出，50℃烘干。

2.2对照品溶液的制备 精密称取白果酸对照品3.50 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得白果酸对照品溶液（0.700 mg/mL）。精密称取总银杏酸对照品2.73 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得总银杏酸对照品溶液（0.546 mg/mL），作为HPLC定位用。

2.3供试品溶液的制备［12］取各样品粉末（过三号筛）约2.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定质量，70℃水浴加热回流3 h，放冷，再称定质量，用无水甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液30 mL，50℃减压回收溶剂至干，残渣加碳酸钠-盐酸缓冲溶液20 mL混悬，用正己烷萃取3次，每次10 mL，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定容于2 mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4色谱条件 U1timate C18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-3%冰醋酸（92∶8）；检测波长310 nm；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min。在上述条件下，5种银杏酸与其他成分均可达到基线分离，色谱图见图1。

图1　白果酸对照品（A）、总银杏酸对照品（B）、白果内种皮（C）HPLC图谱Fig.1　HPLC chromatograms of ginkgoIic acid reference（A），totaIginkgoIic acids reference（B）and endotheIium endop Ieuraof Ginkgo Semen（C）

2.5线性关系考察 分别精密吸取白果酸对照品溶液0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL，置1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。按“2.4”项下色谱条件，分别进样20μL，以进样量Ⅹ（μg）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程Y=558Ⅹ-6.04，r= 0.999 8，线性范围为0.140～11.2μg。

2.6精密度试验 精密吸取白果内种皮供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定白果酸峰面积及5种银杏酸总峰面积。结果RSD分别为0.6%和0.7%。表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验 取白果内种皮供试品溶液，在室温下进行自然放置，分别在0、2、4、6、8、 12 h精密吸取20μL，进样测定，结果6次测得白果酸峰面积的RSD为1.5%，5种银杏酸总峰面积的RSD为2.0%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8重复性试验 取白果内种皮粉末（过三号筛）约2.5 g，共6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20μL，进样测定，计算白果酸和总银杏酸含有量（计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果酸对照品外标法计算总银杏酸含有量），结果白果酸平均含有量为170μg/g，RSD为2.1%；总银杏酸平均含有量为320μg/g，RSD为1.8%。表明方法重复性较好。

2.9加样回收试验 取已知含有量的白果内种皮粉末（过三号筛）共6份，每份约2.5g，精密称定，精密加入白果酸对照品溶液（0.438mg/mL）1mL，再以甲醇补足至50mL，按“2.3”项下方法制备供试液，进样分析，结果见表1。

表1　加样回收率实验结果（n=6）Tab.1 ResuItsofrecoverytests（n=6）

2.10样品测定 精密吸取“2.3”项下白果酸和总银杏酸对照品溶液各20μL及供试品溶液适量（中种皮、内种皮各20μL，胚2μL，其余均为40 μL），注入液相色谱仪，依法测定，并计算样品中白果酸和总银杏酸的量，结果见表2。

表2　样品测定结果（n=2）Tab.2 ResuItsofsampIedetermination（n=2）

3　小结与讨论

3.1研究表明，白果的中种皮、内种皮、胚乳及胚中均含有白果酸、白果新酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸和十七烷一烯银杏酸，以白果酸含有量最高。在白果不同部位中，以胚中白果酸和总银杏酸的量最高，其次是内种皮和中种皮，胚乳中的量最低。白果胚、内种皮和中种皮中总银杏酸的量分别是胚乳的597.5、34.7和26.5倍，且远远超出国际和国内标准，而胚乳中总银杏酸的量接近安全范围，说明白果传统炮制时去壳和去皮心的操作是有其科学道理的。研究提示，对白果加工产品的研发途径之一可将重点转移到可食部分（胚乳）的利用。

3.2目前白果及银杏叶提取物中白果酸的提取方法有石油醚回流提取［1］、甲醇回流提取［11］等方法。经对提取溶剂甲醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯进行比较，结果以甲醇为溶剂，提取效果最佳。对提取方法甲醇回流3h和甲醇超声0.5h、1h进行比较，结果以甲醇回流3h提取量最高。白果中银杏酸含有量低，测定时取样量大，甲醇提取液中含有较多的内酯类、色素类等杂质，干扰测定，且损害色谱柱的使用寿命，故需进一步纯化，本研究参考文献［15］采用正己烷萃取法，加入pH2～3的碳酸钠-盐酸缓冲溶液将银杏酸充分转移到正己烷相中。同时对检测波长、流动相等进行了考察，结果表明，该方法灵敏可靠、重复性好，可用于白果炮制品的定量测定。

3.3白果不同炮制品中白果酸和总银杏酸比较表明，去皮及加热炒、蒸、煮制均可明显降低白果中白果酸和总银杏酸的量，从而降低毒性，但就炒、蒸、煮三种方法而言，炒法温度高，炒制时间短，去毒效果好，而蒸和煮法炮制时间长，且在蒸制和煮制过程中炮制品变色严重。

3.4《中国药典》2010年版收载的炒白果仁要求取全白果仁（带内种皮）炒制，而本实验是取除去内种皮的白果仁炒制，这是因为白果内种皮呈膜质，质地松泡，在炒制时极易脱落而焦糊，严重影响成品外观质量，而去皮后炒则可克服此弊端，且去皮后炒制品中白果酸和总银杏酸的量明显低于药典法炮制品。后期将进一步优化炒白果的工艺技术参数，并探索建立新的去毒工艺。

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Quantitative com parison of ginkgoIic acid and totaIginkgoIic acids in different parts and processed products of Ginkgo semen

LIZhuan-mei， ZHANG Xue-1an*， LIHui-fen， ZHANG Qun-qun
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

AIM To quantitative1y compare the contents of ginkgo1ic acid and tota1ginkgo1ic acids in different parts and processed products of Ginkgo semen.METHODS Methano1 ref1ux and acetate acid were app1ied to the extraction of tota1ginkgo1ic acids，the determination was perfomed on HPLC of the constituents in different parts（mesosperm，endothe1ium endop1eura，endosperm，embryo）and processed products（ho1o-ginkgo semen，kerne1of ginkgo semen，pee1ed kerne1of ginkgo semen，scramb1ing pee1ed kerne1of ginkgo semen，steaming pee1ed kerne1of ginkgo semen，cooking pee1ed kerne1 of ginkgo semen）.RESULTS The measured parts contained ginkgo1ic acid，ginkgoneo1ic acid，hetadecy1-dienoic ginkgo1ic acid，hydroginkgo1ic acid and hetadecy1-enoic ginkgo1ic acid in the order of content，embryo＞endothe1ium endop1eura＞mesosperm＞endosperm.In the order of processed products，ho1o-ginkgo semen＞kerne1 of ginkgo semen＞pee1ed kerne1 of ginkgo semen＞cooking pee1ed kerne1 of ginkgo semen＞scramb1ing pee1ed kerne1 of ginkgo semen，steaming pee1ed kerne1 of ginkgo semen.CONCLUSION The resu1ts show that the method of pee1ing，hot frying，steaming and boi1ing can remarkab1y decrease the contents of ginkgo1ic acid and tota1ginkgo1ic acid in Ginkgo semen.

Ginkgo semen；parts；processing；ginkgo1ic acid；tota1ginkgo1ic acids

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0164-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.035

2014-01-19

济南市高校自主创新计划项目（201303027）

李转梅（1989—），女，硕士生，从事中药新药研发与中药炮制原理研究。Te1：15275172822，E-mai1：1058794709@ qq.com

张学兰（1963—），女，硕士，教授，从事中药新药研发与中药炮制研究。Te1：13406062766，E-mai1：zhang8832440@sina.com