激光二极管激光诱导荧光检测器的研制

何崇慧， 吴 晶， 王廷海， 杨红强

(1.中国石油天然气股份有限公司兰州化工研究中心，甘肃兰州 730060；2.兰州大学化学化工学院，甘肃兰州 730000)

目前用于微流控芯片分析的主要有质谱检测、电化学检测和光学检测器。其中，使用最多的当属激光诱导荧光(Laser Induced Fuorescence，LIF)检测，该方法以其高灵敏度、优良的选择性以及较宽的线性范围得到了最广泛的应用和发展[1 - 3]。国外已有很多商品化的小型激光诱导荧光检测器，但国内目前主要由实验室根据自己需要自行搭建，大大降低了检测的成本，节省了空间，为微流控分析提供了很大的便利，具有很大的应用价值[4，5]。在LIF检测中，气相激光器和[6]固体激光器[7，8]虽然得到广泛应用，但由于价格昂贵、寿命短以及能耗高，限制了其在芯片微流控分析中的应用。发光二极管(LED)由于具有较长的使用寿命、较高的稳定性、较小的体积以及低的成本而成为了一种新型的光源，但也存在一些缺点[9]。另外一种新型的激光光源是激光二极管，它不但价格便宜、体积较小，而且具有较好的光学性能、更好的稳定性和较长的使用寿命。然而，由于技术所限，激光二极管使用的波长范围大多限于近红外区[10]以及红外区范围[11]，而适合这个范围的染料相对于绿光波段范围来说比较少,因此,短波长的激光二极管便得到了迅速的发展。Melanson等人[12]首先在毛细管电泳检测中应用紫色激光二极管，他们在进行用NDA标记的氨基酸时检出限可达10 nmol·L-1。Mathies’s课题组也发明了用400 nm和405 nm激光二极管作为激发光源的微型电泳检测装置[13 - 15]，在检测用普鲁士蓝标记的甘氨酸时检出限可达6 pmol·L-1[15]。

本研究基于低成本的原则，使用一个价格仅为25美元的激光二极管，以及其驱动电源作为激发光源、共聚焦光学结构、光电倍增管作为信号采集装置，构建了一台小型、经济的激光诱导荧光检测器，并对检测器的性能进行了详细考察，同时对不同激发波段的染料标记的荧光物质进行了检测，实验结果表明整个装置成本低廉，灵敏度符合需求 。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F 97 Pro荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)；405 nm激光二极管(20 mW,Sanyo)；激光二极管控制电路(深圳市铂镭激光设备有限公司)；CR105-01光电倍增管(PMT)(北京滨松光子技术股份有限公司)；BF 430 nm二相色镜和BF 460 nm长通滤光片(沈阳汇博光学技术有限公司)；20 X物镜(数值孔径为0.40，北京大悦维佳科技有限公司)；40 X物镜(数值孔径为0.60，重庆麦克尔光学器材有限公司)；NI-6009数据采集卡(美国，美国国家仪器公司)。

氨基酸标准品(西安周鼎国化学试剂有限公司)；荧光胺、FITC isomer I(Sigma-Aldrich公司(美国))；四硼酸钠(西安化学试剂厂)；荧光素钠(FS，天津广成化学试剂有限公司)；羟丙基纤维素((Hydroxypropyl cellulose，HPC，150～400 mpa.s)Bio Basic公司)；丙酮，吡啶，罗丹明，NaOH，浓H2SO4(天津市光复精细化工研究所)；罗丹明B(R-B)，罗丹明6G(R-6G,浙江温州市东升化工试剂厂)。

1.2 405 nm激光诱导荧光检测器的构建

图1 激光诱导荧光检测器的结构示意图

本研究中所构建的检测器示意图如图1所示，主要由激发光源、光路结构、信号采集、数据转换以及数据处理终端即计算机五部分组成。光路采用共聚焦光学结构，正交光路设计，光电倍增管作为光电转换器。激光由激光二极管发出，经过透镜聚焦后垂直射到二向色镜上并被二向色镜反射，通过一个20 X聚光收集物镜到达检测窗口，在通道上形成一个几百微米的光斑。芯片微通道中物质被激发光源激发后产生的荧光通过聚光物镜，再经二相色镜透射，接着被长通滤光片过滤掉杂散光后被45°平面反射镜反射到达PMT信号收集窗口，光信号被PMT捕捉并输出模拟信号，该模拟信号经过放大后由一个NI-6009数据采集卡(National Instruments,Austin,TX,USA)采集，将其转化为数字信号输入电脑进行数据的处理。数据处理采用Labview软件(National Instruments,Austin,TX,USA)。为了得到更大的信噪比(S/N)，采用平均点数法获取数据。

1.3 仪器性能表征

分别用20 X显微物镜和40 X显微物镜作为该检测器的聚光物镜，以荧光胺衍生的亮氨酸作为待测物(浓度10 nmol·L-1)，通过对相同条件下不同放大倍数聚光物镜对于检出限以及峰形的影响来进行物镜放大倍数对于检测器性能的表征。通过考察在激发光源后添加滤光片，同样以荧光胺衍生的10 nmol·L-1亮氨酸作为待测物质进行检出限的测定，考察了激发光源单色性对于检测器性能的影响。用荧光胺衍生的亮氨酸和硼砂溶液作为样品，在暗室中没有其它干扰的情况下通过连续进样4 500 s，进行仪器稳定性的测试。分别稳定增益为200 V至800 V，在每一个增益条件下从15 mA到65 mA调节光源供电电流大小，考察其对于信噪比的影响。在暗室中，去除其他干扰，以荧光素钠作为样品，考察405 nm激光二极管以及473 nm 半导体泵浦激光器对于样品光漂白作用的区别。分别以荧光素钠、罗丹明B、罗丹明6G以及荧光胺衍生的氨基酸，FITC衍生的氨基酸作为样品，进行仪器灵敏度和测量方法精密度的考察。

各类化合物的荧光光谱图在商品化荧光分光光度计上扫描获得。

2 结果与讨论

2.1 仪器使用范围广泛性表征

荧光胺衍生的氨基酸，FITC衍生的氨基酸以及各种染料的荧光光谱图如图2a、b、c所示。同时我们还比较了对于每一种物质在其最佳激发波长和405 nm激发时荧光强度的不同(图2d、e、f)，可以看到对于不同的物质荧光强度的变化程度均有很大的不同，其中荧光胺衍生的氨基酸在405 nm激发时荧光强度的损失最小。该组实验中每一种样品的浓度均为200 nmol·L-1，荧光分光光度计的增益为650 V。

图2 荧光胺标记的氨基酸(a)，FITC标记的氨基酸(b)和各种染料的荧光光谱图(c)；(d,e,f)分别为上述物质在其最佳激发和405 nm激发下荧光强度的变化

通过上述实验结果可以得到，405 nm激光诱导荧光检测器可以应用于不同波段物质的检测，在测蓝绿色染料时，由于不是其最佳激发波长导致灵敏度够高，但是对于一些实际样品的分析以及现场检测的要求足够满足，而且该检测器能同时对不同波段的物质进行检测提高了检测的方便性，降低了检测的成本，体现了该检测器具有广泛使用范围的优点。

2.2 仪器对于不同波段物质灵敏度表征

图3 各种样品的低浓度毛细管电泳分离谱图

分别以荧光素钠、罗丹明B、罗丹明6G以及荧光胺衍生的氨基酸，FITC衍生的氨基酸作为样品，进行仪器灵敏度和测量方法精密度的考察，各种样品的低浓度分离谱图如图3所示。表1为各种样品的检出限，相对标准偏差(RSD)以及线性关系等，检出限的测定均采用3倍的信噪比得到。该检测器检出限为在毛细管上检测荧光胺衍生的亮氨酸时得到，为0.02 nmol·L-1。通过比较在芯片上得到的检出限和毛细管上得到的检出限，发现在毛细管上的到的值稍小一些，原因是COC材料相对于石英来说有一定的荧光背景。实验结果也表明用荧光胺衍生的氨基酸比用FITC衍生的氨基酸检出限低，原因为Ex(荧光胺)=404 nm，而Ex(FITC)=493 nm，即对于FITC来说，405 nm显然不是其最佳激发波长，罗丹明系列染料和荧光素钠检出限稍高的原因与此相同。

通过计算得到用荧光胺衍生的亮氨酸和谷氨酸的迁移时间的相对标准偏差(RSD，n=5)分别为2.56% 和3.70%，对于FITC衍生的亮氨酸和谷氨酸分别为2.19%和1.24%。由此可以看出该方法具有较好的重现性。表1表明了构建的405 nm激光诱导荧光检测器具有较高的灵敏度和较好的重现性。

表1 仪器灵敏度和检测方法的精密度

Because of the series dye of rhodamine has strong adsorption in the COC chip,so they were not detected in the chip electrophoresis.

通过不同激发波段下荧光物质的检测灵敏度表征了该检测器的检测性能，跟文献报道的蓝色LED[5]对于荧光素钠的检出限为0.2 nmol·L-1，绿色LED对于罗丹明B的检出限为1 μmol·L-1[16]，以及绿色的OLED对罗丹明6G的0.01 μmol·L-1的检出限[17]相比，可以看出该检测器除了对于相对应的激发波长即405 nm激发下的物质具有较高的灵敏度之外，对于蓝色和绿色染料同样具有较高的检测灵敏度，所以该检测器可以被广泛的应用于现场实时分析以及快速检测。

2.3 405 nm激光二极管的光斑及强度

图4 普通白纸初始荧光强度图(a),405nm激光二极管照射15min后荧光强度图(b)及普通白纸荧光光斑亮度分布图(c)。阴影部分为所对应毛细管内径大小(75 μm)

一般认为激光二极管的光比较散，光斑面积比较大，所以我们以普通白纸作为考察对象，用实验中所用的激光二极管进行照射，分别取刚开始照射以及照射15 min以后的图像来考察光斑面积对于实验中芯片检测的影响。从图4a和4b可以看出来，经物镜汇聚，405 nm激光可汇聚在一个很小的斑点。在照射一段时间后，荧光强度显著降低，且中心部位的荧光淬灭远比边上严重，说明中心部位的光强较高。图4c为光斑亮度的分布图，从该图中可以看出，中心部位的大小与毛细管内径相当，只要调节得当，激光二极管的能量能得到充分利用。

图5 增益大小以及光源供电电流大小对信噪比(S/N)的影响

2.4 仪器稳定性考察

用荧光胺衍生的亮氨酸和硼砂溶液作为样品，在暗室中没有其他干扰的情况下通过连续进样4 500 s，进行仪器稳定性的测试。结果表明，在长时间进样后，对于不同的样品，其信号基本保持在一条直线上，说明该检测器对于实验中用到的各种样品均具有较好的稳定性。

2.5 光源供电电流和增益大小对于信噪比的影响

确定激光光源供电电流的情况下，可以由调节光电倍增管的增益值进行调整信号放大倍数，但是光电倍增管的增益值的调节也会影响背景噪音值的大小。本研究中以1 μmol·L-1的荧光素钠作为待测样品，分别稳定增益为150 V至700 V，在每一个增益条件下从15 mA到65 mA调节光源供电电流大小，考察其对于信噪比的影响。如图5所示，在固定光源供电电流时，信噪比随着增益的增加而增加，当增益为500 V时，信噪比达到最大值，然后开始下降(在某些电流下，当增益增大的时候，信号会超过5 V，而5 V为电泳程序设置的时候纵坐标的最高值，谱图中的峰发生了畸变，不能反映真实性能，所以在计算信噪比的时去掉了那些峰高超过5 V的数据)。为了得到较大的信噪比以及漂亮的峰形，实验中选择300～600 V增益为最佳增值益范围。同样，在固定增益值的情况下，信噪比随着光源供电电流的增加而增加。综合考虑到激光二极管的寿命，实验中选择光源供电电流为45 mA。

2.6 光漂白作用的考察

由于担心波长较短的405 nm激光产生过强的光漂白作用，所以在暗室中，以200 μmol·L-1的荧光素钠作为样品，考察405 nm激光二极管以及473 nm半导体泵浦激光器对于样品光漂白作用的区别。从图6可以看出来，405 nm激光二极管相对于473 nm的激光器对荧光素钠的光漂白作用没有本质区别。

2.7 物镜放大倍数对仪器性能的影响考察

为了考察物镜放大倍数对于检测器性能的影响，分别用20 X显微物镜和40 X显微物镜作为该检测器的聚光物镜，以荧光胺衍生的亮氨酸作为待测物质(浓度为10 nmol·L-1)，通过对相同条件下不同放大倍数聚光物镜对于检出限的影响以及峰形的影响进行物镜放大倍数对于检测器性能影响的表征，如图7所示，实验发现当物镜从20 X 改为 40 X时，灵敏度增加了几乎5倍，但考虑到物镜的工作距离，在实验中我们选择20 X作为检测器聚光物镜。

图6 不同激发光源对于荧光素钠光漂白作用的考察

图7 20× 和 40×物镜下荧光胺衍生的亮氨酸的芯片电泳谱图

3 结论

本研究构建了405 nm紫色半导体激光诱导荧光检测器，并对仪器的各种性能进行了表征。结果表明，该检测器具有稳定性好、灵敏度高、检出限低、可实现数据的实时输出等优点。并且通过实际样品的分离实验，进一步证明了该LIF足以达到所需灵敏度，将其应用于医药、农残等实际样品的检测中，具有很大的现实意义和使用价值。