HPLC法同时测定吉祥草中阿魏酸及芦丁

田源红， 张永萍， 李 玮， 徐 剑， 王建科， 刘 赟

（贵阳中医学院，贵州　贵阳　550002）

HPLC法同时测定吉祥草中阿魏酸及芦丁

田源红， 张永萍*， 李 玮， 徐 剑， 王建科， 刘 赟

（贵阳中医学院，贵州贵阳550002）

目的 建立吉祥草中阿魏酸和芦丁的测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法，Wondasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸水（38∶62），体积流量为1 mL/min，检测波长270 nm；柱温30℃。结果 阿魏酸在0.40～2.40μg范围内呈良好线性关系（r=0.999 9），平均回收率为100.1%，RSD为2.8%；芦丁在0.625～5.625μg范围内呈良好线性关系（r=0.999 95），平均回收率为100.7%，RSD为1.3%。结论 该方法分离效果好，操作简单，稳定性好，重复性好，可用于吉祥草中阿魏酸和芦丁的测定。

吉祥草；RP-HPLC；阿魏酸；芦丁

吉祥草又名观音草，为百合科植物吉祥草Reineckia carner（Andr.）Kunth的干燥全草。具有滋阴润肺、凉血止血的功效，用于肺燥咳喘、阴虚咳嗽、咯血、遗精、跌扑损伤。在《本草纲目》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》中均有记载，苗族、侗族、布依族喜用鲜品治疗咳嗽等［1-2］。是咳速停糖浆、咳速停胶囊、复方吉祥草片等制剂的主要药物。近年来发现其中还含有Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Ca、K等8种微量元素，且含有量较高，具有较高的药用价值［3］。还发现具有溶血、止咳、化痰、抗炎、降血糖的作用［4-5］。阿魏酸是抑菌作用的有效成分，芦丁是止咳作用的有效成分［6］，本实验同时对两成分定量测定方法进行了研究，为提高吉祥草的质量控制方法提供依据。

1　药材

吉祥草经贵阳中医学院汪毅教授鉴定为百合科植物吉祥草Reineckia carner（Andr.）Kunth的干燥全草。

2　仪器与试药

2.1仪器 高效液相色谱仪（日本岛津/LC-20AT）、超声波清洗机（北京创新德超声电子研究所）、SHZ-95型循环水式真空泵（河南巩义市予华仪器有限公司）、AE-240双量程电子分析天平（万分之一，十万分之一）、HH-2型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、色谱柱（ACE C18、WondaSil C18、Diamonsil C18）。

2.2试药 阿魏酸对照品（贵州迪大生物科技有限责任公司，供含量测定用，批号1135-24-6），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号100080-200707），色谱甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20130501），娃哈哈纯净水，分析纯甲醇、乙醇、磷酸。

3　试验方法

3.1对照品溶液的的制备 精密称取阿魏酸对照品0.016 g，于100 mL量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，即得每1 mL含阿魏酸0.16 mg的溶液；另取芦丁对照品0.025 g，于100 mL量瓶中，同法即得每1 mL含芦丁0.25 mg的溶液。

3.2供试品溶液的制备

3.2.1提取方法考察 分别用超声提取［7］、回流提取［8］、索氏提取，结果用回流提取的方法两成分的峰面积最大，且分离度、拖尾因子较好，故选用回流提取。

3.2.2正交试验 精密称取吉祥草全草粉末约1 g于100 mL圆底烧瓶中，以料液比、甲醇体积分数、提取时间、提取次数为四因素，各3个水平设计实验方案，9个样品，回流提取，过滤，滤液水浴挥干，残渣加用1 mL甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，进样10μL。测定峰面积，计算。因素水平及实验结果见表1～4。

表1　因素水平Tab.1 Level of factors

表2　实验结果Tab.2 Results of the experiment

表3　阿魏酸方差分析Tab.3 Variance analysis of ferulic acid

表4　芦丁方差分析Tab.4 Variance analysis of rutin

从表2得出：影响阿魏酸因素依次为C＞D＞B＞A，最佳方案为A3B2C2D3；影响芦丁因素依次为C＞D＞A＞B，最佳方案为A2B3C3D3。提取时间、提取次数影响较大。

从表3、4得出：料液比、甲醇体积分数、提取时间、提取次数对吉祥草中阿魏酸和芦丁的量无显著性差异。

综上所述，考虑到节约溶剂和时间，提取方案为A3B2C2D2，即：料液比（1∶30）、甲醇质量分数（90%）、提取时间（1 h）、提取次数（2次）作为提取吉祥草的最佳提取条件。即：精密称取吉祥草全草粉末约1 g于100 mL圆底烧瓶中，精密加入30 mL 90%甲醇回流提取1 h，过滤，滤液备用，再将滤纸放入圆底烧瓶中同法回流1 h，合并两次滤液，水浴挥干，残渣加用1 mL甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，进样10μL。

3.3色谱条件 WondaSilC18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸水（32∶68）；体积流量1.0 mL/min，检测波长270 nm；柱温30℃。

3.3.1色谱柱的选择 分别对ACEC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、DiamonsilC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、WondaSilC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）进行试验，结果表明，WondaSilC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的色谱柱分离效果好，故选择此色谱柱。

3.3.2最大吸收波长的选择 对200～400波段进行扫描，芦丁在波长365 nm处有最大吸收，阿魏酸在265 nm处有最大吸收波长。通过实验比较选择的最适吸收波长为270 nm。

3.3.3流动相的选择 先后对甲醇-0.4%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-水、甲醇-水-乙酸（45∶54∶1）［9］6种流动相进行试验。根据试验结果，选择甲醇-0.4%磷酸水（32∶68）作为流动相。

3.4方法学考察

3.4.1绘制标准曲线 分别取质量浓度为0.16 mg/mL的阿魏酸标准溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15μL注入高效液相色谱仪，记录其峰面积，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得回归方程y=3×106x-29 728（r=0.999 9），结果表明阿魏酸在0.40～2.40μg范围内呈良好线性关系；同法精密量取质量浓度为0.25 mg/mL的芦丁标准溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15、22.5μL注入高效液相色谱仪，记录其峰面积。得出回归方程y=2×106x-1 684.5（r=0.999 95），结果表明芦丁在0.625～5.625μg范围内呈良好线性关系。样品、对照品HPLC图谱见图1。

图1　吉祥草HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of Reineckia carner

3.4.2精密度试验 精密吸取按正交试验优选出的最佳提取工艺制备的供试品溶液，每次进样10 μL，重复进样6次，测定峰面积，结果阿魏酸峰面积RSD为1.7%，芦丁峰面积RSD为1.6%，结果表明仪器精密度良好。

3.4.3稳定性试验 精密吸取同一吉祥草样品，每次进样10μL，分别于0、2、4、6、8、12 h依次进样，测定峰面积，结果阿魏酸峰面积RSD为2.4%，芦丁峰面积RSD为0.9%，结果表明样品在12 h内稳定。

3.4.4重复性试验 精密称取同一吉祥草样品粉末6份，每份约1 g，制备供试品溶液，每次进样10μL，测定峰面积，计算，结果阿魏酸RSD为2.9%，芦丁RSD为2.3%，表明该方法重复性良好。

3.4.5回收率试验 分别称取已知含有量吉祥草样品粉末（阿魏酸0.119 mg/g和芦丁0.425 mg/g）6份，每份约0.5 g，精密加入阿魏酸对照品（0.103 mg/mL）溶液0.6 mL和芦丁对照品（0.220 mg/mL）溶液1 mL，按供试品项下制备，进样10μL，测定峰面积，计算，阿魏酸平均回收率为100.1%、RSD为2.8%，芦丁的平均回收率为100.7%，RSD为1.3%，表明该方法的回收率良好。见表5，表6。

表5　阿魏酸加样回收率试验Tab.5 Results of recovery tests for ferulic acid

表6　芦丁加样回收率试验Tab.6 Results of recovery tests for rutin

3.4.6样品测定 精密吸取3批吉祥草药材的供试液10μL分别进样，记录峰面积，计算阿魏酸和芦丁的量，结果见表7。3批吉祥草中的阿魏酸含有量在0.011%～0.013%之间，芦丁含有量在0.047%～0.054%之间。

表7　阿魏酸、芦丁测定结果Tab.7 Determ ination results of ferulic acid and rutin

4　结果与讨论

4.1体积流量的选择 分别对0.8、0.9、1.0 mL/min的体积流量进行考察，结果表明1.0 mL/min时峰面积最大。

4.2柱温的选择 分别对25℃［10］、30℃［11］、35℃［12］三个柱温进行试验，结果表明30℃时峰型最佳，故选择柱温为30℃。

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Determ ination of ferulic acid and rutin in Reineckia carner（Andr.）Kunth.by HPLC

TIAN Yuan-hong， ZHANG Yong-ping， LIWei， XU Jian， WANG Jian-ke， LIU Yun
（Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guizhou 550002，China）

Reineckia carner（Andr.）Kunth；RP-HPLC；ferulic acid；rutin

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0603-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.031

2014-04-04

贵州省科技计划项目（黔科合重G字［2012］4 001号）；贵州省教育厅中药、民族药产地加工与炮制技术工程中心（黔教合KY字［2012］021号）

田源红（1963—），女，教授，硕士生导师，从事中药材民族药材炮制工艺及质量研究。Tel：13511931919，E-mail：tyh0831@sohu.com

张永萍（1964—），女，教授，硕士生导师，从事中药新制剂新剂型新技术研究。Tel：（0851）5652056，E-mail：zgygpg @sohu.com