HPLC法同时测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸和川续断皂苷Ⅵ

季宁平， 徐晓秋， 傅超美， 刘 芳， 胡慧玲

（成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川　成都　610075）

［质 量］

HPLC法同时测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸和川续断皂苷Ⅵ

季宁平， 徐晓秋， 傅超美*， 刘 芳， 胡慧玲

（成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都610075）

目的 建立同时测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ的高效液相色谱法。方法 艾附暖宫丸50%甲醇提取液的高效液相色谱分析以C18色谱柱为固定相，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，体积流量1 mL/min，柱温为30℃，线性梯度洗脱，芍药苷、川续断皂苷Ⅵ检测波长为230 nm、阿魏酸检测波长为321 nm。结果 芍药苷在0.502～5.016 7μg（r=0.999 3）范围内、阿魏酸在0.147～1.760μg（r=0.999 8）范围内、川续断皂苷Ⅵ在0.975～11.480μg（r=0.999 5）范围内，对照品进样质量和色谱峰峰面积呈良好线性关系，加样回收率分别为97.8%、100.5%和97.6%，RSD值分别为2.0%、2.0%和1.8%。结论 建立的高效液相色谱法简便稳定、准确可靠，可用于艾附暖宫丸的质量控制。

艾附暖宫丸；高效液相色谱；芍药苷；阿魏酸；川续断皂苷Ⅵ

艾附暖宫丸是由艾叶（炭）、香附（醋炙）、当归、川芎、白芍（酒炒）、续断、吴茱萸（制）、肉桂、地黄、黄芪（蜜炙）十味中药经粉碎成细粉加炼蜜制得的小蜜丸或大蜜丸，具有理气养血、暖宫调经的功效，主要用于血虚气滞、下焦虚寒所致的月经不调、痛经等症［1］。其疗效确切，为治疗寒凝冲任所致的月经不调等症的代表成药。目前市面所售艾附暖宫丸成方制剂品种规格多样，相关质量控制研究文献较少，其中多数只采用了某单味饮片的成分定量测定作为质控指标［2-4］，质控指标稍显单一，且《中国药典》2010年版该项下仅进行了芍药苷测定，专属性差，难以全面评估其质量优劣。目前，多数高效液相设备配备有可进行多波长测定的检测器，能同时进行至少两种以上波长的测定，可同时测定多种成分，已广泛地应用到多数饮片、提取物及制剂的质量控制中［5-7］，其中较多使用双波长同时测定多种成分法。基于此，本实验旨在建立一种较为简便的能同时测定艾附暖宫丸中多种成分的高效液相色谱法［8-12］。

1　仪器与试药

岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪（配有紫外检测器、自动进样器、二元梯度泵、岛津LC-Solution色谱工作站，日本岛津公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德国赛多利斯公司）；电热套ZDHW型（北京中兴伟业仪器有限公司）。

艾附暖宫丸（样品1，购于康贝大药房，批号20131001；样品2，购于康寿大药房，批号20120954；样品3，购于万安大药房，批号20130801；样品4，购于荣州大药房，批号1210740）；芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号120903-200809）；阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号0773-9910）；川续断皂苷Ⅵ对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号101227）；色谱乙腈（美国天利公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性试验 Global C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，10%A；5～35 min，10%～20%A；35～52 min，20%～30%A；52～67 min，30%～50% A；67～82 min，50%～60%A）；体积流量1 mL/min；柱温30℃；芍药苷、川续断皂苷Ⅵ检测波长为230 nm，阿魏酸为321 nm。对照品溶液、供试品及阴性样品的色谱图，见图1。

2.1.1对照品溶液的制备 取芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.502、0.147、0.975 mg/mL的混合溶液，即得。

图1　艾附暖宫丸HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Aifu Nuangong Pills

2.1.2供试品溶液的制备 取样品适量，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性样品的制备（专属性考察） 按《中国药典》2010年版中“艾附暖宫丸”的制法制备缺少芍药、川芎、当归、续断的水蜜丸，再按照“2.1.2”项下制备阴性供试品。

2.2线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10、12μL进样测定，记录峰面积值，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，建立回归方程，见表1。

表1　各对照品回归方程、相关系数及线性范围Tab.1 Regression equation，correlation coefficient and linearity and range of each reference substance

2.3精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（样品1，批号20131001）10μL，重复进样6次，测定峰面积。芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积的RSD值分别为0.1%、0.1%、0.1%，表明仪器精密度良好。

2.4重复性试验 同一样品（样品1，批号20131001）按“2.1.2”项下平行制备6份供试品溶液，每份溶液精密取10μL进样2次，测定峰面积，计算。芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ含有量的RSD值分别为1.1%、2.6%、2.1%，表明方法重复性良好。

2.5稳定性试验 取同一供试品溶液（样品1，批号20131001），室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10μL进样，测定峰面积。芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积的RSD值分别为0.4%、0.4%、0.8%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.6加样回收试验 取已知含有量的艾附暖宫丸样品（样品1，批号20131001）1 g，精密称定，共6份。每份样品分别精密加入质量浓度为1.231 mg/mL的芍药苷对照品溶液2 mL、0.183 mg/mL的阿魏酸对照品溶液1 mL、1.214 mg/mL的川续断皂苷Ⅵ溶液2 mL，按“2.1.2”项下方法按照相应的比例制备供试品溶液，精密吸取50μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，计算回收率，见表2。芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ的平均回收率分别为97.8%、100.5%和97.6%，RSD值分别为2.0%、2.0%和1.8%。

表2　加样回收率试验（n=6）Tab.2 Results of recorery tests（n=6）

2.7样品测定 取3个批号的艾附暖宫丸，按“2.1.2”项及“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行制备3个，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，记录色谱峰峰面积，采用标准曲线法，将所测定的峰面积带入相应的回归方程中，计算，结果见表3。

表3　不同厂家艾附暖宫丸中3种成分测定结果（±s，n=3）Tab.3 Determ ination results of three contents from differentmanufacturers（±s，n=3）

表3　不同厂家艾附暖宫丸中3种成分测定结果（±s，n=3）Tab.3 Determ ination results of three contents from differentmanufacturers（±s，n=3）

注：“—”表示未检测出。

样品 批号芍药苷/（mg·g-1）川续断皂苷Ⅵ/（mg·g-1）阿魏酸/（mg·g-1）样品120131001 2.519 4±0.033 2.470 4±0.022 0.186 7±0.003样品2 20120954 2.018 0±0.004 2.096 5±0.018 0.205 1±0.009样品3 20130801 1.752 5±0.028 2.005 8±0.031—样品4 1210740 1.194 1±0.022 1.615 8±0.011 0.229 1±0.023阴性样品实验室自制———

3　讨论

3.1提取方法的选择 本实验对提取方法进行了考察，加热回流法和超声法之间存在显著性差异，加热回流法的提取效果显著高于超声法，所以选择加热回流法作为提取方法。并且采用单因素试验法，分别对提取溶媒（体积分数分别为25%、50%、75%和100%甲醇溶液）和提取时间（30、45、60min）进行考察。结果表明，除25%的甲醇溶液提取效率较低以外，其他3种体积分数溶媒提取效果无显著性差异，从减小成本角度出发，选择50%的甲醇作为提取溶媒；加热回流30 min即可将成分基本提取完全，故本实验中各供试品溶液的提取方法为：用50%甲醇溶液加热回流30 min。

3.2流动相的优化 为使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间较为合理，在参考了文献［13-15］的基础之上结合多次预试，最终确定以乙腈-0.1%磷酸溶液系统为流动相进行梯度洗脱。流动相中加入适量的酸可以改善峰的分离度并防止峰的拖尾，考虑到固定相对酸的承受能力，所以选择0.1%的磷酸溶液。

3.3检测波长的确定 由于芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ三者的最大吸收波长，经预实验，其中芍药苷（230 nm）与川续断皂苷Ⅵ（212 nm）最大吸收波长接近，川续断皂苷Ⅵ对照品在230 nm与212 nm色谱峰面积相差不大，且212 nm近端吸收较严重，也受检测器限制，仅能作双波长测定，为进行同时测定故选择230 nm作为川续断皂苷Ⅵ的吸收波长，而阿魏酸的最大吸收波长为321 nm与230 nm色谱峰面积相差较大，且所使用高效液相色谱仪支持双波长测定，故确定阿魏酸检测波长为321 nm。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：285.

［2］ 张 雷，李琴韵，胡蓓莉，等.HPLC测定艾附暖宫丸中吴茱萸次碱含量［J］.中成药，2006，28（8）：1239-1240.

［3］ 李捷玮，金柔男，李 翔，等.多种中成药中芍药苷的含量测定［J］.药物分析杂志，2009，29（9）：1440-1443.

［4］ 孙文基，高 海，郝武常，等.香附及其制剂中α-香附酮的GC法测定［J］.中成药，1993，15（2）：31-32.

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［15］ 鄢 燕，汤宏敏，饶 毅，等.多波长高效液相色谱法测定学府逐瘀口服液中5种有效成分［J］.药物分析杂志，2009，29（3）：347-350.

Determ ination of paeoniflorin，ferulic acid and asperosaponinⅥin Aifu Nuangong Pills by HPLC

JINing-ping， XU Xiao-qiu， FU Chao-mei， LIU Fang， HU Hui-ling
（Pharmacy College，Chengdu Uniυersity of Traditional Chinese Medicine；The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Deυelopmentand Utilization of ChineseMedicine Resources，Chengdu 610075，China）

AIM To setup an HPLCmethod for determining three bioactive components，paeoniflorin，ferulic acid and asperosaponinⅥin Aifu Nuangong Pills.METHODS The chromatographic separation ofmethanolic extract of Aifu Nuangong Pillswas performed on Global-C18（250mm×4.6mm，5μm）column in a gradientelution manner using amixture of acetonitrile and 0.1%phosphoric asmobile phase.The flow ratewas1mL/min and column temperaturewasmaintained at30℃.The detection wavelength of paeoniflorin and asperosaponinⅥwas set up at230 nm，ferulic acid at321 nm.RESULTS The linear range was 0.502-5.016 7μg（r=0.999 3）for paeoniflorin，0.147-1.760μg（r=0.999 8）for ferulic acid and 0.975-11.480μg（r=0.999 5）for asperosaponinⅥ.The average recoverieswere 97.8%for paeoniflorin with RSD=2.0%，100.5%for ferulic acid with RSD=2.0%，and 97.6%for asperosaponinⅥwith RSD=1.8%，respectively.CONCLUSION Themethod is simple and convenient，reliable and accurate，it can be utilized as a quality controlmethod for Aifu Nuanging Pills. KEY WORDS：Aifu Nuangong Pills；HPLC；paeoniflorin；ferulic acid；asperosaponinⅥ

R927.2

A

1001-1528（2015）03-0534-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.016

2014-05-09

四川省科技支撑计划（310931）

季宁平，硕士生，从事中药制剂新技术新方法研究。Tel：13882189250，E-mail：504549915@qq.com

傅超美，博士，教授，博士生导师，从事中药新制剂、新剂型和新技术研究。Tel：（028）61800236，E-mail：chaomeifu @126.com