硫酸链霉素发酵过程控制对发酵单位影响的研究

杨森 李薇 方媛 任朝君

摘 要：硫酸链霉素生产使用灰色链霉菌（Streptomyces Griseus），此次实验过程中是以四级发酵为基本工艺生物合成链霉素。在此次发酵实验中，主要对四级种子的发酵时间工艺选择，以及控制发酵罐pH值、溶氧条件控制这些发酵过程中关键性因素进行了一系列的生物发酵实验的探索，以实际生物发酵数据为基础，最大化的提高链霉素的发酵单位，革新硫酸链霉素的发酵工艺。

关键词：硫酸链霉素；工艺创新

链霉素是1944年发现的一种氨基糖苷类药物，用于治疗结核病的有效抗生素。作为一种老的抗生素，链霉素不仅是治疗结核病的主要药物，而且在农业方面的应用也越来越广泛。链霉素作为工业化发酵工艺，其影响发酵单位的因素是相当复杂的；在抗生素发酵过程中，影响菌体生产和产物形成的因素很多，各参数之间相互关联，变化其中某一个参数，常会引起其他参数的变化。在实际工业中，积累了大量过程生产数据，大多数情况下是弃之不用的。这主要是因为这些数据关联程度高，很难从表面上判断过程特点和规律，从而指导实践生产[1]。并且，其营养物质的来源、空气质量、pH、溶氧条件、搅拌等因素都直接或者间接的影响着菌丝生物发酵的过程；为此，我们在实验中经过大量的实验和数据对比，首先，确定了最佳种子培养的周期，使其发酵过程前期避免了氨氮消耗过快影响发酵单位的增长；其次，细化和革新pH与溶氧条件，优化了链霉素的生长和代谢环境使其始终处在一个次级代谢旺盛的发酵阶段。

材料与方法

1 材料

1.1 菌种 硫酸链霉素灰色链霉菌由华北制药华胜公司提供。

1.2 发酵种子工艺对营养物质的选择

初级子种培养基：葡萄糖、黄豆粉、硫酸铵、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆、消后体积300L，消前pH自然，30℃培养。

中级增速培养基：葡萄糖、黄豆粉、硫酸铵、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆，消后体积2m3，消前pH自然，30℃培养。

三级放大培养基：葡萄糖、黄豆粉、硫酸铵、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆，消后体积6m3，消前pH值调至6.0以上，30℃培养

发酵罐营养培养基：低温饼粉、硫酸铵、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆、配置体积42m3，消前pH值调制pH6.5-6.8。

1.3 三级种子周期对发酵前期单位的影响

从链霉菌代谢和产生链霉素的机理上分析，丝状菌深層培养时，主要的繁殖方式是借菌丝断片来形成新菌丝体；效价的高低和增长幅度可以表证菌丝的生长代谢阶段，也可以反映种子菌丝的质量。所以，种子罐效价，尤其是三级（末级）种子罐效价与发酵罐水平具有较强的相关性。移种时机在发酵过程控制中的重要性。应选择对数生长末期，即将进入分化的相对年轻的菌丝作为种子，其表观物理特征是菌丝量最大；由此，我们将发酵种子周期经行了细化分析：

表1 四级发酵种子周期对应发酵前期单位

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][初级

24h

22h

22h

24h

20h

18h

26h][中级

24h

22h

24h

24h

22h

22h

26h][三级

24h

28h

26h

28h

28h

28h

20h][三级种子放罐单位

890

990

850

1000

998

790

460][发酵罐40小时单位

2350

3100

2460

3089

3102

2209

1550]

从表中分析可以得出，对于初级与中级种子培养，其目的是菌丝生长的初级阶段，其培养周期在20-24小时为最佳；而从表中可以看出，三级种子的发酵末端，为其对数生长期，在对数生长期接种会改善了种子液质量，增强了发酵能力，提高发酵单位。

由此，我们根据种子罐的代谢阶段调节三级种子罐的培养时间，考虑到生产效能，前两级种子罐合理的移种周期应该在20小时，三级种子在28小时接种，这样可以避免糖、氮过度消耗使菌丝老化，已达到经济和工艺效益的最大化。

1.4 发酵过程控制工艺对发酵单位的影响

通过生产批记录数据分析新思路的引入，我们发现发酵pH值是影响发酵单位的显著因素；由于葡萄糖作为硫酸链霉素的一个重要前体物质，我们大胆提出pH+溶氧调控理念，通过调整pH值和溶氧条件来控制发酵过程对葡萄糖的代谢比，以期达到提高发酵单位的目的。

控制发酵过程中最适pH与溶氧值。在实验过程中，我们利用在线pH电极和发酵自动控制系统，通过补料系统补加氨水，闭环控制使硫酸链霉素发酵过程中处于我们设定的pH值，做到发酵过程pH的稳定。并且，我们通过安装在发酵罐中的溶氧电极，时时测定发酵过程中的溶氧参数，以控制搅拌的转动频率来控制发酵过程中的溶氧参数，下表为实验过程中的发酵数据：

表2 发酵过程周期单位对应pH值和溶氧值

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][周期

24h

48h

72h

96h

120h

144h

168h

192h

发酵放罐单位][pH自控值

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

24679][pH自控值

6.0-6.5

6.2-6.5

6.5-6.6

6.5-6.7

6.7-6.9

6.7-6.9

6.9-7.0

7.0-7.2

28215][搅拌全程工频

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

26503][根据溶氧按需供应

25Hz

30Hz

45Hz

40Hz

55Hz

60Hz

65Hz

65Hz

26612]

在此次實验过程中，pH单项实验的搅拌功率都是工频；搅拌单项实验的pH值是按pH值全程6.0-7.2；从上表中可以看出，链霉素在发酵过程中并不需要全程搅拌全开；按照溶氧电极显示的数据经行按需开搅拌能在不影响发酵单位的前提下有效节约能源；在pH自控值的探索中，我们经过大量实验确定了各个时间点的对应pH值数据；是其菌丝一直处在利于发酵代谢的环境当中。

2 结论

通过此次实验和数据总结，我们确定了硫酸链霉素发酵种子培养最佳周期，使其能在对数生长期的最佳时刻接种；并且利用pH电极和溶氧电极创新了链霉素的发酵工艺，细化了发酵工程，提高了发酵水平。

参考文献：

[1]陈元青，陈琦，王树青，等.多元统计分析方法在链霉素发酵中的应用[J].生物工程报，1999，15（3）：368-372.

作者简介：杨森（1986-），男，河北邯郸人，任职于华北制药股份有限公司新制剂分厂，职称：医药工程助理工程师学士学位，研究方向：发酵工程与工艺。