PCR和限制性内切酶在uPA-SCID小鼠基因型鉴定中的应用

徐春华，陈丽香，任晓楠，杨玉琴，彭秀华，蔡家麟，周晓辉，周文江，2

（1. 上海市公共卫生临床中心，上海 201508；2. 复旦大学药学院，上海 201203）

PCR和限制性内切酶在uPA-SCID小鼠基因型鉴定中的应用

徐春华1，陈丽香1，任晓楠1，杨玉琴1，彭秀华1，蔡家麟1，周晓辉1，周文江1，2

（1. 上海市公共卫生临床中心，上海 201508；2. 复旦大学药学院，上海 201203）

目的建立一种简便、快捷、准确的基因型鉴定方法用于uPA-SCID小鼠的基因型鉴定。方法应用PCR技术与限制性内切酶相结合的方法检测uPA-SCID小鼠的基因型。结果uPASCID小鼠的uPA基因型鉴定结果显示: uPA基因野生型在153 bp有条带，纯合子在337 bp有条带，杂合子在337 bp、153 bp有条带。uPA-SCID小鼠的SCID基因型鉴定结果显示: uPA-SCID小鼠SCID基因突变体在38 bp、26 bp有条带，杂合子在64 bp、38 bp、26 bp有条带，野生型在64 bp有条带。结论建立的基因型鉴定方法简便易行、可靠，通过该方法可以确定uPA-SCID小鼠的基因型，筛选出需要的纯合子uPA-SCID小鼠。

uPA-SCID小鼠；基因型鉴定；聚合酶链反应（PCR）；限制性内切酶

uPA-SCID小鼠由SCID小鼠与uPA转基因小鼠杂交、自交后产生［1，2］，该小鼠整合了这两个品系小鼠的特点，既患有严重的肝脏疾病，又缺失适应性免疫系统［3］。由于uPA-SCID小鼠的肝细胞所具有的代谢缺陷，使移植的外源细胞比小鼠自身的肝细胞更容易存活［4］，这些特质使它们的肝脏可成功复育异种（人）肝，可作为人肝细胞移植的模型［3，5］。

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是1980年代中期发展起来的体外核酸扩增技术［6，7］，具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点，因此已在各领域被广泛应用。但正因为敏感度高，易受其他因素的影响，要得到准确可靠的反应结果，需根据不同的模板，摸索最适合的条件，配制出PCR反应试剂。作者经过多次的重复实验，找到了最适合uPA-SCID小鼠uPA基因DNA的PCR扩增条件。

限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，但对自身DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。人类在基因工程中则是利用其可以识别特定的位点，从而产生已知序列的粘性末端，这样就可以与PCR技术等其他基因工程手段结合［8-10］，实现对基因的切断。

uPA-SCID小鼠近年来才在国际上应用较广泛。上海公共卫生临床中心实验动物部从美国Jackson实验室引入SCID小鼠和uPA转基因小鼠，育成了uPA-SCID小鼠（国内尚未见报道）。为了繁育及后续实验的需要，须准确、快速地区分野生型、杂合子、纯合子的uPA-SCID小鼠。作者应用PCR和限制性内切酶相结合，建立了uPA-SCID小鼠基因型鉴定的方法流程，在1.5 d内就能筛选出杂合子和纯合子的uPA-SCID小鼠。

1　材料与方法

1.1实验动物繁殖及处理

SCID小鼠和uPA转基因小鼠引自美国Jackson实验室，原代种鼠在上海市公共卫生临床中心实验动物部［SCXK（沪）2010-0024］隔离器中饲养4周后，采用雄∶雌=1∶1的同居方式进行繁殖，母鼠妊娠后单笼饲养。产生F1代小鼠之后，用F1代小鼠自交产生F2代小鼠。再将F2代中的uPA纯合子小鼠与SCID纯合子小鼠杂交，产生uPA-SCID小鼠。

1.2试剂和仪器

DNA提取试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司；限制性内切酶购自New England公司；DNA Marker DL 2000购自广州杰顺生物科技有限公司；Mark购自Promega公司；实验使用的仪器有: Eppendorf台式高速离心机、Eppendorf移液枪，PK-8D型恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司），BCT-Power 600电泳仪（Baygene公司）；BIO-RAD凝胶图像处理系统；HL-2000杂交炉（UVP公司）和T3000 thermocycler PCR仪（Bionetra公司）。

1.3基因型鉴定方法

1.3.1小鼠基因组DNA的抽取剪取2周龄小鼠的尾组织约3 mm，将小鼠尾组织置于含20 μL蛋白酶K溶解液及250 μL裂解液（DNA基因提取试剂盒中）的Eppendorf管中，在56 ℃的水浴锅中消化过夜，并按照血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒的操作步骤抽提基因组DNA。

1.3.2小鼠基因组DNA的PCR扩增（a） uPA-SCID小鼠uPA基因DNA的PCR扩增: 将已经提取的小鼠组织DNA取1 μL样品作为反应模板，PCR扩增采用25 μL体系: 2×PCR master mix 12.5 μL，引物oIMR0432（10 μmol/L）0.5 μL，引物oIMR0433 （10 μmol/L） 0.5 μL，引物oIMR0434（10 μmol/L） 0.5 μL，模板1 μL ，ddH2O 10 μL。PCR反应条件: 94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃保持2 min，10 ℃ 保存。（b） uPA-SCID小鼠SCID基因DNA的PCR扩增: 将已经提取的小鼠组织DNA取2 μL样品作为反应模板，PCR扩增采用50 μL体系: 2×PCR Master mix 25 μL，正向引物（20 μmol/L） 0.5 μL，反向引物（20 μmol/L） 0.5 μL（鉴定的引物序列为: 正向引物5'-GGA AAA GAA TTG GTA TCC AC-3'，反向引物5'-GTTGGCCCCTGCTAACTTTC-3'），模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。 PCR反应条件: 94 ℃预变性1.5 min，94℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃保持2 min，10 ℃ 保存。

1.3.3限制性内切酶消化PCR产物每个样品取5 μL uPA-SCID小鼠SCID基因DNA的PCR扩增产物加入0.5 μL Alu1进行酶切，在HL-2000杂交炉消化3 h。

1.3.4琼脂糖凝胶电泳法分离消化过的PCR 产物及分析PCR反应结果的基因型鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法。（a）uPA-SCID小鼠uPA基因型鉴定：首先制备10 g/L的琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，加适量电泳缓冲液，最后加入 uPA-SCID小鼠uPA基因DNA 的PCR扩增产物，130 V电压30 min，对产物进行分析。 （b）uPA-SCID小鼠SCID基因型鉴定: 首先制备50 g/L琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，加适量电泳缓冲液，最后加入经限制性内切酶消化过的PCR产物，电泳1h，对产物进行分析，若为野生型则无法被Alu1酶切，若为SCID突变体则会被切为几个小片段。

2　结果

2.1uPA-SCID小鼠uPA基因型鉴定结果

用PCR检测uPA-SCID小鼠uPA基因型，uPA基因野生型在153 bp有条带，纯合子在337 bp有条带，杂合子在337 bp、153 bp有条带（图1）。

图 1　uPA-SCID小鼠uPA基因型鉴定结果

2.2uPA-SCID小鼠SCID基因限制性内切酶酶切基因鉴定结果

用限制性内切酶检测uPA-SCID小鼠SCID基因型，限制性内切酶消化过的PCR产物表现3种类型，即3种基因型: SCID突变体有2条DNA 带38 bp，26 bp。SCID杂合子有3条DNA带64 bp，38 bp，26 bp。野生型有1条DNA带64 bp（图2）。

3　讨论

乙型肝炎病毒（HBV）感染严重威害人类的健康，是全球性的主要问题之一［11］。据估计［12-14］全球大约20亿人感染HBV，每年死于肝炎病毒超过100万人，因此积极寻找和建立HBV感染的动物模型显得尤为重要。目前，国际上已有部分实验室成功产生uPA-SCID小鼠，并用此小鼠构建了嵌合小鼠肝脏模型。上海公共卫生临床中心实验动物部通过杂交和自交方式，产生uPA-SCID小鼠，并对其基因型进行鉴定，现在已能稳定地繁育。

图 2　uPA-SCID小鼠SCID基因限制性内切酶酶切基因鉴定结果

PCR技术需根据不同的模板摸索最适合的条件，配制PCR反应试剂。经过许多次的重复实验，作者找到了最适合uPA-SCID小鼠DNA的PCR扩增条件，并改进了从小鼠尾组织中提取DNA的方法，能有效防止DNA的污染。

在应用PCR扩增DNA片段的基础上，利用SCID突变体小鼠与其亲本株C.B-17小鼠的DNA测序结果不同，在Tyr-4046位发生了碱基T A的突变，从而形成新的内切酶Alu1识别位点这一特性，将PCR产物通过限制性内切酶Alu1进行酶切，测定uPA-SCID小鼠的SCID基因型。该方法不但有效解决了单纯运用PCR技术检测uPA-SCID小鼠的SCID基因型时假阳性率高的问题，同时操作简便易行，鉴定结果准确。

uPA- SCID小鼠接种异种肝细胞应该在出生后尽早进行，因此基因型鉴定过程的时间长短是一个很重要的因素。运用PCR结合限制性内切酶的方法，采用新生2周龄仔鼠作为基因型鉴定对象［15］，此法只需要很少的生物材料即3 mm的小鼠尾组织，适用于任何年龄小鼠。通过这种方法，从取材到基因型确定可以在一个半工作日内完成。

运用作者建立的uPA- SCID小鼠基因型鉴定方法流程，可以有效地确定uPA-SCID小鼠的基因型，筛选出需要的小鼠供繁育和实验所用。

［1］吴腾，邢丽英，勾红菊. ApoE-/-，SAP-Tg小鼠模型的构建［J］.广东药学院学报，2013，29（05）:539-542.

［2］亓翠玲，叶杰，郭四美. Rip1-Tag2；PSGL-1-/-小鼠模型的构建［J］. 广东药学院学报，2013，29（1）:76-78.

［3］Meuleman P，Libbrecht L，De Vos R，et a1. Morphological and biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera［J］. Hepatology，2005，41:847-856.

［4］张海斌，何志颖，杨广顺. 人源化肝脏嵌合体小鼠的研究进展［J］ . 中华肝脏病杂志，2011，19（5）:398-400.

［5］Mercer DF，Schiller DE，Elliott JF，et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers［J］，Nat Med，2001，7（8）:927-933.

［6］王廷华，刘佳，夏庆杰，等. PCR理论和技术［M］. 北京: 科学出版社，2013.

［7］ 荣齐仙.甘草药材中甘草酸含量变异的分子标记研究-rbcL、trnL内含子、IGS和matK［D］. 北京中医药大学，2007.

［8］赵利伟，胡朝晖，陈文聪，等. PCR-酶切技术快速鉴定军团菌［J］. 微生物学通报，2013，40（8）:1514-1520.

［9］曲良苗，陈文炳，缪婷玉，等. 限制性内切酶酶切确证河豚鱼成分PCR检测结果［J］. 食品科学，2014，35（8）:169-173. ［10］ 王红，金煜，宋防. 限制性内切酶法在苯丙酮尿症突变基因诊断中的应用［J］. 中华医学检验杂志，2008，2，31（2）: 186-187.

［11］ 巫贵成，周卫平. 乙型肝炎病毒感染的自然史研究进展［J］.中华肝脏病杂志，2001，9（1）:55-57.

［12］ 刘石柱，孙殿兴 . 乙型肝炎病毒PreSl的研究进展［J］. 国际病毒学杂志，2012，19（5）:233-236.

［13］ 刘义庆，栾芳，赵跃然，等. 乙型肝炎病毒感染与肝外细胞及自身免疫病的研究进展［J］ .中国医药，2013，8（10）:1515-1517.

［14］ 丁善龙，王杰，鲁凤民. 乙型肝炎研究及我国防治现状［J］.传染病信息，2013，26（6）:369-372.

［15］ 徐培渝，Jerlin Walker. PCR 和限制性内切酶法快速检测C57BL/ 6J ob 小鼠基因型 ［J］. 癌变·畸变·突变，2000，9（3）:143-145.

Application of PCR and Restiction Enzyme in Genotype Identification of uPA-SCID Mouse

XU Chun-hua1，CHEN Li-xiang1，REN Xiao-nan1，YANG Yu-qin1，PENG Xiu-hua1，CAI Jia-lin1，ZHOU Xiao-hui1，ZHOU Wen-jiang1，2
（1. Shanghai Clinical Center of Public Health，Shanghai 201508，China，2. School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai 201203，China）

ObjectiveTo set up a simple，fast and accurate method for the genotype identification of uPA-SCID mouse . MethodThe genotype of uPA-SCID mouse was detected by using PCR combined with restriction enzyme. ResultThe genotype identification results of uPA showed that the stripes of wild type in 153 bp，the stripes of homozygous in 337 bp，and the stripes of heterozygote in 337 bp and 153 bp. The genotype identification results of SCID showed that the mutant genes stripes in 38 bp and 26 bp，the heterozygote genes stripes in 64 bp，38 bp and 26 bp，and the wild type stripes in 64 bp. ConclusionThe method established is simple and accurate，it can identify the genotypes of uPA-SCID mouse，and screening the needful homozygous uPA-SCID mouse.

uPA-SCID mouse；Genotype identification；PCR；Restriction enzymes

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0218-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.008

2014-08-06

徐春华（1982-），男，从事实验动物设备管理。E-mail: xuchunhua@shaphc.org

周文江（1965-），男，主任技师，主要从事实验动物管理及动物模型建立的实验研究。E-mail: wjzhou@shmu.edu.cn