小鼠胆囊胆固醇结石模型的建立

毛立梅戴建华张晏苗包蔚雷高园园朱春富张京平▲

1.南京医科大学附属常州市第二人民医院药剂科，江苏常州 213003；2.南京医科大学附属常州市第二人民医院普通外科，江苏常州 213003

小鼠胆囊胆固醇结石模型的建立

毛立梅1戴建华1张晏苗1包蔚雷2高园园2朱春富2张京平2▲

1.南京医科大学附属常州市第二人民医院药剂科，江苏常州 213003；2.南京医科大学附属常州市第二人民医院普通外科，江苏常州 213003

目的 建立简单、可靠、高效的小鼠胆囊胆固醇结石模型，为研究胆石成因及防治提供重要手段。方法 C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组，对照组喂饲基础饲料，模型组喂饲致石饲料（基础饲料加10%猪油、1%胆固醇及0.5%胆酸）。两组小鼠分别于喂养4周和8周后，计算小鼠存活率，同时各取一半数量小鼠在乙醚吸入麻醉下手术取胆囊及血液标本，分别检测成石率、血脂浓度及胆汁胆固醇饱和度。 结果 对照组小鼠8周存活率100%，模型组小鼠死亡1只，存活率95%。对照组8周成石率为零，模型组4周成石率80%，8周成石率100%。血脂分析表明，与对照组比较，模型组4周和8周总胆固醇及低密度脂蛋白显著升高（P＜0.01），甘油三酯浓度轻度升高（P＜0.05），高密度脂蛋白显著降低（P＜0.01）。4周和8周时胆汁胆固醇饱和度测定，对照组分别为0.48±0.29和0.58±0.21，模型组分别为1.36±0.36和1.52±0.37，模型组胆固醇浓度处于过饱和状态。 结论 本模型方法简单、成石率高、动物死亡率低，可作为研究胆石成因及防治的备选模型。

胆固醇结石；胆囊；模型；小鼠

胆囊结石（主要为胆固醇结石）是常见病，且其发病率有增高趋势［1］。目前胆囊结石的形成机制尚不清楚［2-3］。建立方法简单、效果确切的胆囊结石动物模型可以为研究胆石成因及其防治提供极大便利。本文介绍一种简单、高效的C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石模型的建立方法。

1　材料与方法

1.1 饲料及处理

基础饲料按照美国营养学会啮齿类AIN-93标准配方制定［4］。致石饲料为基础饲料加10%猪油、1%胆固醇及0.5%胆酸。致石饲料在喂饲前放于蒸笼中蒸汽熏蒸20min，取出适当冷却后使用。

1.2 动物及分组

C57BL/6小鼠32只，8周龄，雌雄各半，清洁级，购自上海斯莱克实验动物中心。购入后经普通基础饲料喂养2周后，随机分为两组，对照组12只，雌雄各半，每日以普通基础饲料喂养；模型组20只，雌雄各半，每日以致石饲料喂养。两组小鼠分别于喂养4周和8周后，各取一半数量小鼠在乙醚吸入麻醉下手术取材作相关指标检测。

1.3 小鼠存活率测定

饲养过程中记录各组小鼠存活情况，计算存活率。

1.4 胆囊胆固醇结石观测

各组分别取胆囊，在显微镜下观察胆固醇结晶形成情况；抽取胆囊胆汁，1000rpm离心后取沉渣在显微镜下观察胆固醇结晶形成情况，采用红外光谱溴化钾压片法鉴定结石性质［5-6］。

1.5 血脂测定

经心脏穿刺抽血，分离血浆后采用CX-7型全自动生化分析仪（美国Beckman）测定血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）浓度。

1.6 胆囊胆汁胆固醇饱和度测定

抽取胆囊胆汁，离心去除胆固醇结晶，经适当稀释后在全自动生化分析仪上测定胆汁总胆固醇、磷脂和总胆汁酸，通过Carey表［7］计算胆固醇饱和指数（cholesterol saturation index，CSI）。

1.7 统计学分析

2　结果

2.1 小鼠存活情况

对照组小鼠在8周饲养过程中全部存活，存活率100%。模型组小鼠在饲养过程中死亡1只，存活率95%。

2.2 成石情况

对照组4周和8周胆囊内胆汁澄清，皆未见结石结晶形成（图1-A，图2-A），成石率为零。模型组4周时即见胆囊内胆汁浑浊，10只小鼠中有8只可见结石结晶形成，成石率为80%，8周时剩余9只全部检测到结石，成石率为100%（图1-B，图2-B），红外光谱溴化钾压片法鉴定为胆固醇结石。

图2 显微镜下观察胆汁标本（×40）

2.3 各组血脂测定结果

两组小鼠不同时间点血脂水平见表2。与对照组比较，模型组4周和8周TC浓度显著升高（P＜0.01）；模型组8周与4周时比较无显著差异（P＞0.05），说明模型组4周时血液总胆固醇浓度已处于较高水平，继续致石饲料饲养并不能进一步显著增高总胆固醇浓度。与对照组比较，模型组4周和8周TG浓度轻度升高（P＜0.05），升高幅度小于TC。与对照组比较，模型组4周和8周HDL-C显著降低（P＜0.01），而LDL-C显著升高（P＜0.01）。

表2 两组小鼠不同时间点血脂水平（± s，mmol/L）

表2 两组小鼠不同时间点血脂水平（± s，mmol/L）

组别　TC　TG　HDL-C　LDL-C 4周　8周　4周　8周　4周　8周　4周　8周对照组　2.08±0.29　2.15±0.45　0.51±0.16　0.54±0.18　1.56±0.29　1.54±0.33　1.09±0.16　1.12±0.16模型组　5.38±0.82　6.10±0.80　0.77±0.23　0.79±0.20　0.97±0.22　0.88±0.21　2.03±0.25　1.99±0.29 t -11.64　-11.05　-2.53　-2.54　4.66　4.89　-7.91　-7.64 P 0.00　0.00　0.02　0.03　0.00　0.00　0.00　0.00

2.4 CSI测定结果

对照组小鼠4周和8周时CSI分别为0.48±0.29和0.58±0.21，皆小于1，说明胆固醇处于未饱和状态。模型组小鼠4周和8周时CSI分别为1.36±0.36和1.52±0.37，皆大于1，说明胆固醇浓度处于过饱和状态。

3　讨论

建立理想的胆囊胆固醇结石动物模型是研究胆石成因及其防治的重要手段。目前已有较多文献报道建立胆囊胆固醇结石模型的方法［8-11］，但尚无统一、标准化的方法。理想的动物模型要求动物获取方便、造模方法简单、成石率高、可重复性好和动物死亡率低等。我们在借鉴文献介绍方法的基础上，成功建立了C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石动物模型。我们的结果表明，该造模方法具有简单、实用、成石率高及动物存活率高等优点。

对于造模动物的选择，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模动物［8-10］。相对于其他动物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有价格低廉、获取方便，同时针对小鼠的各种抗体及检测方法等亦更加丰富与齐全。因此我们选择了C57BL/6小鼠作为造模对象。致石饲料是建立胆囊胆固醇结石模型的关键因素［8-12］。在我们的前期实验中，我们综合文献介绍的方法，采用的饲料配方包括基础饲料加胆固醇、蛋黄粉、蔗糖等成分及较高浓度的猪油（15%）和胆酸（1%），尽管获得了较高的成石率（8周100%），但实验小鼠不愿进食或进食量较少，存活率较低（约40%到70%）。分析其原因可能与致石饲料中成分较多、脂类与胆酸含量较高、成品饲料质地偏硬、油脂味较重，导致小鼠咬食困难或不愿意进食等因素有关。在本研究中，我们去除了饲料中非必须成分，并降低了猪油与胆酸的浓度；同时，为降低饲料的硬度，我们在喂饲前将饲料在蒸汽中熏蒸，使其变松软后再喂饲，小鼠进食量明显增多。本研究结果表明，该配方简单，成石率高，动物存活率较高，8周造模完成时存活率达95%。

高脂物质的摄入及高血脂形成是人类胆固醇结石形成过程中的重要环节之一［13-14］。本模型中，小鼠在喂饲致石饲料后4周即出现了高血脂，其中主要为总胆固醇的显著升高以及甘油三酯的轻度升高。同时，脂蛋白浓度亦出现了相应的改变。在胆固醇结石形成机制中，目前认为胆汁成分中胆固醇过饱和是形成胆固醇结石的重要条件［15-16］。在本模型中，我们检测到实验组小鼠胆固醇饱和指数大于1，即胆固醇过饱和的存在。因此，本模型通过摄入高脂物质形成高血脂、胆汁胆固醇过饱和，最终导致胆固醇结石形成，有效地模拟了人胆固醇结石的形成过程，不失为研究胆固醇结石形成机制及防治的较好模型。

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Establishment of a C57BL/6 mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet

MAO Limei1DAI Jianhua1ZHANG Yanmiao1BAO Weilei2GAO Yuanyuan2
ZHU Chunfu2ZHANG Jingping2
1.Department of Pharmacy，Changzhou No.2 People's Hospital，Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China；2.Department of General Surgery，Changzhou No.2 People's Hospital， Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China

Objective To establish a mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group. Mice of control group were fed with normal diet and those of experimental group were fed with lithogenic diet，which included 10% fat，1% cholesterol and 0.5% cholic acid. After 4- and 8-week's feeding， mice were sacrificed respectively and specimens were collected for further assay. Results The survival of mice was 100% in control group and 95% in experimental group in the end of 8-week's feeding.In control group，there was no gallbladder cholesterol stone formation.In experimental group，the rate of stone formation was 80% in week 4 and 100% in week 8， respectively. Blood lipid analysis indicated that the level of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol were significantly higher in experimental group than those in control group in both week 4 and week 8 （P＜0.01）.On the other hand， the level of blood triglyceride in experimental group was slightly higher versus that in control group （P＜0.05） and high-density lipoprotein cholesterol remarkably lower versus that in control group （P＜ 0.01）. Bile analysis showed that super saturation of bile cholesterol in experiment group happened but no super saturation in control group. Conclusion It is a good method reported in this paper for the establishment of C57BL/6 mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet.

Cholesterol gallstone；Gallbladder；Model；Mouse

R285.5

A

2095-0616（2014）06-30-04

2013-12-10）