陈海玲, 蔡端容
(1.泉州医学高等专科学校,福建泉州 362100 2.德国林内因斯特有限公司驻厦门代表处,福建厦门 361024)
黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是一类具有强毒性和致癌性的化合物[1,2],目前分离鉴定出来的有20余种,主要污染粮油及其制品和动植物食品,如花生、大米、小麦、玉米、坚果类、乳制品等[3]。黄曲霉毒素的毒性大小依次为黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G2(AFG2),因此,食品样品中AFB1、AFG1、AFB2、AFG2的同时检测是现在食品安全监测的热点之一[4 - 7]。婴幼儿时期是人生发展的重要阶段,也是最脆弱的时期,婴幼儿食品的安全不容马虎。市场上婴幼儿辅食种类、口味繁多,但材料常以米、面为主,如常见的婴幼儿米粉、营养面。国家标准(GB10765-2010)明确规定了婴儿配方食品中AFB1的限量为0.5 μg/kg[8],该限量值明显低于谷物、豆类等其原料食品(5 μg/kg)[9]。欧盟国家要求更低,婴幼儿食品中AFB1的限量为0.1 μg/kg,总量(AFB1+ AFB2+GAF1+AFG2)不得超过4 μg/kg[10]。因此高灵敏同时测定婴幼儿食品中4种黄曲霉素非常重要。
黄曲霉毒素的常见检测方法主要有薄层色谱法[11]、酶联免疫分析法[12]、高效液相色谱法[13 - 17]、液相色谱串联质谱法[2,6,7,16,17]。本文利用电化学柱后衍生方法,针对低含量样品采用低标准线性系列,测定了多种婴幼儿辅食中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。方法重现性好,回收率高,检出限低,满足欧盟国家对婴幼儿辅食中黄曲霉毒素的限量要求。
LC-20A液相色谱仪(日本,岛津公司),配RF-10Axl荧光检测器;电化学衍生装置(德国,Coring cell,Code3200130);磁力搅拌器(美国,Thermo);研磨机(德国,IKA);固相萃取装置(美国,Aglient);电子天平(梅特勒-托利多(上海)公司;单道数字可调微量移液器(法国,吉尔森);免疫亲和柱(1 mL,德国AFLAPREP)。
黄曲霉素标准品:AFB1:3.270 μg/mL,AFB2:2.890 μg/mL,AFG1:3.266 μg/mL,AFG2:3.131 μg/mL,国家标准物质网)。黄曲霉素标准溶液:分别准确吸取300 μL的AFB1、AFG1标准溶液,100 μL的AFB2、AFG2标准溶液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2浓度分别为98.1、28.9、97.98、31.31 ng/mL的标准储备液。再用流动相制备AFB1为0.4905、0.9810、1.472、4.905、9.810 ng/mL,AFB2为0.1445、0.2890、0.4335、1.445、2.890 ng/mL,AFG1为0.4899、0.9798、1.470、4.899、9.798 ng/mL,AFG2为0.1566、0.3131、0.4698、1.566、3.131 ng/mL标准系列溶液。色谱流动相:准确称取0.1190 g KBr溶于600 mL水中,加200 mL甲醇、200 mL乙腈、100 μL浓HNO3,磁力搅拌15 min直至无分层现象,过0.45 μm有机滤膜。缓冲溶液:分别称取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4、2.90 g NaH2PO4·12H2O于烧杯中,用水溶解后转移到1 L容量瓶中,用水定容至刻度,充分混合均匀,过0.45 μm滤膜。缓冲溶液于每次使用前配制。丙酮、甲醇、乙腈为色谱纯,HNO3为优级纯,其他所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。
1.2.1仪器工作条件色谱柱:Intersil ODS-SP C18柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm);荧光检测器:λex=362 nm,λem=440 nm;流动相流速:0.700 mL/min;进样量:50 μL,柱温:30 ℃。测试时液相流速从0.2000 mL/min逐步升到0.7000 mL/min,待压力稳定后,接通电化学衍生仪,工作电流为100 μA。
1.2.2样品提取及净化准确称取20.00 g米粉或营养面条样品(面条需粉碎)于250 mL锥形瓶中,加入80 mL丙酮∶水=4∶1(V/V),磁力搅拌45 min,过滤。然后取2.00 mL滤液于带螺盖的离心管中,加入30 mL缓冲溶液,充分振荡均匀。将混合液转移至连接到固相萃取装置上的免疫亲和柱中,流速控制在1滴/秒。用20 mL缓冲溶液以5 mL/min的流速分三次淋洗柱子。用500 μL流动相分三次淋洗柱子,流速控制在1滴/秒。将收集到的洗脱液用0.22 μm有机滤膜过滤,供上机测试。
电化学衍生装置Coring cell是利用电化学原理,以在线发生的Br2为衍生剂。测定时装置接通电源,流动相中的KBr在电流作用下被还原生成Br2,后者可与AFB1及AFG1反应产生其溴化物可提高荧光强度,反应如下:
图1 纯米粉样品(a)和加标200 μL标准储备液样品(b)的色谱图Fig.1 Chromatogram of rice flour sample(a) and sample spiked with 200 μL of aflatoxin stock standard(b)
在优化仪器工作条件下,对5个浓度梯度的标准溶液进行分析, AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的出峰时间分别为17.8、22.3、23.7、30.0 min。按上述方法,空白纯米粉样品和加标200 μL的色谱图见图1。
按实验方法对黄曲霉素混合标准溶液进行测定,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分别在0.4905~9.810、0.1445~2.890、0.4899~9.798、0.1566~3.131 ng/mL范围内与其响应信号成线性关系,线性回归方程分别为:y=4.238E-006x、y=2.422E-006x、y=4.581E-006x和y=3.881E-006x,相关系数分别为0.9995、0.9999、0.9998和0.9999。以3倍信噪比计算方法的检出限,得到纯米粉样品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限分别为0.05、0.02、0.04、0.02 μg/kg。
选取4个不同品牌、不同种类的米粉、营养面条样品,按实验方法各平行处理6份进行测定,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的相对标准偏差(RSD)分别为2.0%~3.6%、2.7%~6.0%、1.7%~4.2%、1.1%~2.6%。取某品牌纯米粉样品,按实验方法平行处理6份进行测定,测得AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的日内RSD分别为2.1%、2.8%、2.5%、1.6%。连续处理3 d,每天平行处理6份,其日间RSD依次为6.7%、8.2%、6.0%、4.6%。
在未检出目标物的某品牌纯米粉空白样品中,分别添加混合标准储备液200、500、1 000 μL,按实验方法进行处理,平行测定3次,计算回收率,结果见表1。从表1可以看出,本方法可以满足4种目标黄曲霉毒素同时检测的要求。
表1 回收率实验结果(n=3)Table 1 Results of recovery test(n=3)
采用丙酮-水溶液(4∶1,V/V)提取、免疫亲和柱净化,电化学衍生-高效液相色谱法同时检测了婴幼儿辅食中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。该方法操作简单,重现性好、回收率高、检出限低,完全满足欧盟国家对婴幼儿辅食的黄曲霉毒素检测的限量要求,能够在进出口食品检测领域中推广。