1RS-7DS.7DL小麦-黑麦小片段易位系的鉴定

李俊，朱欣果,，万洪深，王琴，唐宗祥，符书兰，杨足君，杨漫宇，杨武云

1.四川省农业科学院作物研究所，农业部西南地区小麦生物学与遗传育种重点实验室，成都 610066；

2.四川农业大学农学院，四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室，温江 611130；

3.电子科技大学生命科学与技术学院，成都 610054

1RS-7DS.7DL小麦-黑麦小片段易位系的鉴定

李俊1，朱欣果1,2，万洪深1，王琴1，唐宗祥2，符书兰2，杨足君3，杨漫宇1，杨武云1

1.四川省农业科学院作物研究所，农业部西南地区小麦生物学与遗传育种重点实验室，成都 610066；

2.四川农业大学农学院，四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室，温江 611130；

3.电子科技大学生命科学与技术学院，成都 610054

黑麦(Secale cereale L.,RR)是改良普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD)的重要基因资源，将黑麦优异基因转移到普通小麦中，是小麦品种改良的有效途经之一。文章将四川地方品种蓬安白麦子(T.aestivum L., AABBDD)与秦岭黑麦(S.cereale cv.Qinling,RR)杂交，染色体自动加倍获得八倍体小黑麦CD-13(AABBDDRR)；通过顺序FISH和GISH分析，发现该八倍体小黑麦1RS端部与7DS的端部发生相互易位，是一个携带1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位染色体的八倍体小黑麦。利用八倍体小黑麦CD-13与四川推广小麦品种川麦42杂交、连续自交，获得包含60个株系的F5群体；对F5群体的58个株系进行GISH和FISH分析发现，其中13个株系含有1RS-7DS.7DL小片段易位染色体。在这13个株系中，株系811染色体数目为2n=6x=42，是稳定的1RS-7DS.7DL小片段易位系；并且1RS特异分子标记和醇溶蛋白分析表明，1RS-7DS.7DL易位染色体1RS小片段的断裂点位于分子标记IB267-IAG95之间，不包含编码黑麦碱蛋白的Sec-1位点；同时1RS-7DS.7DL小片段易位系的千粒重与川麦42相当，远远高于八倍体小黑麦CD-13，对千粒重无负作用。因此，1RS-7DS.7DL小麦-黑麦小片段易位系可作为进一步深入研究1RS小片段上的优异基因及其遗传效应的重要材料。

小麦；黑麦；1RS-7DS.7DL；小片段易位

黑麦(Secale cereale L.,2n=2x=14,RR)携带大量抗病、抗逆、高产等优良基因[1~6]，是普通小麦(Triticum aestivum L.,2n=6x=42,AABBDD)遗传改良的重要基因资源。通过小麦–黑麦远缘杂交，一些黑麦的染色体或染色体片段已被导入普通小麦，特别是黑麦1R染色体短臂(1RS)的导入，为普通小麦的改良做出了巨大贡献[7~13]。黑麦1RS携带抗虫、抗条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病以及提高产量和环境适应性的基因[14~21]，过去几十年来一直被育种家广泛应用。截至目前，鉴定出的小麦–黑麦易位系超过16个[8,22,23]，其中，常用的小麦–黑麦易位系主要是1RS.1AL、1RS.1BL、1RS.1DL[9,15,20,23~25]，其中利用1RS.1BL易位系育成的高产、抗病的推广品种最多[9,26]。

然而，由于1RS.1BL易位系白粉病、条锈病抗性的逐渐丧失，及其Sec-1(黑麦碱)基因会显著降低小麦品质[27,28]，从而限制了1RS导入系在小麦改良中的应用。近年来，研究者已利用不同来源的1RS创制了新的抗病易位系，一定程度上解决了抗病性丧失的问题[29,30]；通过各种手段，也获得了一批黑麦碱基因缺失的小麦–1RS易位系。Lukaszewski[31,32]和Anugrahwati等[33]通过各种1RS.1BL易位系间部分同源重组和遗传操作，获得了黑麦碱基因缺失的1RS-1BS.1BL小片段改良重组体；Masoudi-Nejad等[34]利用杀配子系统成功将小片段1RS易位到小麦2A、2D、3D、5D和7D染色体，并产生了Sec-1位点缺失的1RS-5DL.5DS、1RS-3DL.3DS和1RS-7DS.7DL小麦–黑麦非部分同源小片段易位染色体，其1RS小片段来源于黑麦Imperial。目前，由于受遗传补偿效应的影响，育种应用效果较好的小麦–黑麦易位通常发生在部分同源群间，而非部分同源易位在小麦育种上应用的相关报道很少。

本研究利用四川地方品种蓬安白麦子(T. aestivum L.,AABBDD)与秦岭黑麦(S.cereale cv. Qinling,RR)杂交、染色体自动加倍获得1份八倍体小黑麦CD-13(AABBDDRR)。通过顺序荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization,GISH)分析，发现该八倍体小黑麦1RS端部与7DS的端部发生相互易位，产生了1RS-7DS.7DL小麦–黑麦非部分同源小片段易位染色体。本研究利用八倍体小黑麦CD-13与四川推广品种川麦 42杂交并自交，将1RS-7DS小麦–黑麦小片段易位成功转入到小麦品种川麦42中。利用GISH、FISH技术和分子标记技术鉴定CD-13/川麦42 F5群体中的1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位染色体，通过对 F5中含有1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位染色体株系千粒重的分析，初步探讨该非部分同源小片段易位对千粒重的影响，为进一步利用1RS-7DS.7DL易位染色体进行普通小麦遗传改良奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

八倍体小黑麦CD-13是1993-1995年由蓬安白麦子与秦岭黑麦杂交，自动加倍和结实后获得。本研究以八倍体小黑麦CD-13为母本，川麦42为父本，杂交后再连续自交至F5代，获得包括60个株系的F5群体；对其中58个发芽正常的株系(每个系10粒种子)分别进行GISH和FISH分析。

1.2 方法

1.2.1 原位杂交

采用GISH和FISH的方法对所有材料的根尖细胞中期染色体进行分析鉴定。根尖细胞中期染色体的制备、探针标记方法和原位杂交程序按照Han等[35]描述的方法。GISH分析中，用秦岭黑麦基因组DNA作探针。此外，用重复序列pTa-535[36]和pSc119.2[37]为探针进行FISH分析。八倍体小黑麦CD-13采用顺序FISH和GISH分析方法，先进行FISH，褪色后再进行GISH。

1.2.2 1RS染色体分子标记分析

采用CTAB方法，提取八倍体小黑麦CD-13、蓬安白麦子、秦岭黑麦、川麦42及F5代的58个株系的幼嫩叶片DNA。利用黑麦1RS特异分子标记及编码黑麦碱的Sec-1位点的标记SEC-1和SEC-1b[38~42]，检测携带1RS染色体臂或片段的株系及其亲本八倍体小黑麦CD-13和川麦42，分析1RS-7DS.7DL中小片段易位的断裂点。分子标记由宝生物公司(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd)合成，标记序列见表1。黑麦1RS特异分子标记的PCR反应体系及程序参照Lei等[38]的方法，特异标记SEC-1和SEC-1b的PCR反应体系及程序分别参照Masoudi-Nejad[34]和张立平等[41]的方法。

1.2.3 醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分析

采用1986年ISTA颁布的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH3.2)标准程序检测供试材料的黑麦碱蛋白，在此基础上凝胶溶液和染色液的比例略有改动。凝胶溶液配置比例为：10%的丙烯酰胺，0.4%的亚甲基丙烯酰胺，6%的尿素，0.1%抗坏血酸和0.004%硫酸亚铁；染色液配置比例为：10%的三氯乙酸和4%考马斯亮蓝R-250。

表1 黑麦1RS染色体上的特异分子标记

1.2.4 千粒重测定

2012、2013两年在成都种植CD-13/川麦42群体及其亲本CD-13、川麦42、蓬安白麦子、秦岭黑麦。按照随机区组设计，2次重复，每个株系种植1行，行长1.5 cm，行距20 cm，采用免耕、条沟点播、细土盖种栽培方式。通过定苗使不同株系的基本苗数一致，播前和苗期进行化学除草，中后期施药防治蚜虫，收获后测千粒重。

2 结果与分析

2.1 八倍体小黑麦CD-13中的小片段易位鉴定

图1 八倍体小黑麦CD-13根尖中期细胞的FISH(A)和GISH(B)分析A：以pTa-535(红)和pSc119.2(绿)为探针进行FISH分析；B：以秦岭黑麦基因组DNA(红)为探针进行GISH分析。短箭头所指为1RS-7DS.7DL易位染色体，长箭头所指为7DS-1RS.1RL易位染色体。

采用顺序FISH(图1A)和GISH(图1B)的方法分析八倍体小黑麦CD-13，以pTa-535[36]和pSc119.2[37]为探针进行FISH分析；以秦岭黑麦基因组DNA为探针，中国春基因组DNA为封阻进行GISH分析。结果表明，八倍体小黑麦CD-13染色体数目为56，包括42条小麦染色体和14条黑麦染色体(图1)；其中，2对染色体发生小麦–黑麦染色体易位。八倍体小黑麦CD-13中的1RS端部与7DS的端部位置发生相互易位，即7D染色体上7DS端部与1RS端部易位(1RS-7DS.7DL)，1R染色体上1RS端部与7DS端部易位(7DS-1RS.1RL)(图1)。

2.2 小片段易位的遗传转育

选取八倍体小黑麦CD-13与川麦42杂交F5代群体中的58个发芽正常的株系用于GISH和FISH分析。结果发现，22个株系含有黑麦染色质(表2)，所占比例为37.9%；其中，10个株系染色体数目为42，1个株系染色体数目为41，4个株系染色体数目为43，6个株系染色体数目为44，1个株系染色体数目为45。

含有黑麦染色质的22个株系中，7个株系含有整条黑麦染色体，2个株系含有1对1RS.wheat?(未知小麦染色体)易位染色体，13个株系含有1RS-7DS.7DL易位染色体，所占比例分别为12.07%、3.45%、22.41%。含有整条黑麦染色体的7个株系中，1个株系含有1对4R染色体，1个株系含有1对6R染色体，1个株系含有1条6R染色体，1个株系含有1对7R染色体，1个株系含有1对4R染色体和1条7R染色体，1个株系含有1条1RL染色体臂和1条7R染色体，1个株系含有1条未知黑麦染色体。对于7个含有黑麦整条染色体和2个含有1RS.wheat?染色体的株系将进一步鉴定后再做详细分析。

表2 八倍体小黑麦CD-13/川麦42 F5群体中含有黑麦染色质的株系

含有1RS-7DS.7DL易位染色体的13个株系中，6个株系含有 1对 1RS-7DS.7DL染色体和 1对7DS-1RS.1RL染色体(图2A)；1个株系含有1对1RS-7DS.7DL染色体(图2B)；2个株系仅含有1条1RS-7DS.7DL染色体(图2C和2D)；1个株系含有1对1RS-7DS.7DL染色体和1条7DS-1RS.1RL染色体；1个株系含有1条1RS-7DS.7DL染色体和1对 7DS-1RS.1RL染色体；1个株系含有 1条1RS-7DS.7DL染色体和1条7DS-1RS.1RL染色体；1个株系含有 1条 1RS-7DS.7DL染色体和 1条1RS.wheat?易位染色体。以上携带1RS-7DS.7DL小片段易位染色体的株系中，3个株系仅含1RS-7DS.7DL易位染色体，其中765(图2C)和799(图2D)株系染色体数目为42，含1条1RS-7DS.7DL易位染色体；编号为811的株系染色体数目为42(图2B)，含1对1RS-7DS.7DL易位染色体，是纯合的1RS-7DS.7DL易位系。由此表明，八倍体小黑麦CD-13携带的1RS-DS.7DL小片段易位染色体被成功转入六倍体普通小麦中，并且能够稳定遗传。

2.3 1RS-7DS.7DL易位染色体中1RS断裂点分析

利用A-PAGE对CD-13/川麦42 F5群体中含有1RS染色体臂或片段的15个株系及亲本进行醇溶蛋白分析，发现F5群体中765、799和811株系及亲本蓬安白麦子、川麦42不含ω区域的黑麦碱蛋白的3条带，秦岭黑麦、CD-13及其他12个株系均含有黑麦碱蛋白的3条带(图3，表3)。由此表明，765、799和811株系黑麦碱蛋白缺失。

图2 八倍体小黑麦CD-13/川麦42 F5代中的染色体易位以秦岭黑麦基因组DNA(红)、pTa-535(红)和pSc119.2(绿)为探针进行原位杂交，染色体用DAPI染色(蓝)。箭头示易位染色体，短箭头所指为1RS-7DS.7DL，长箭头所指为7DS-1RS.1RL。A：株系769，2n=42，含1对1RS-7DS.7DL和1对7DS-1RS.1RL易位染色体；B：株系811，2n=42，含1对1RS-7DS.7DL易位染色体；C：株系765，2n=42，含1条1RS-7DS.7DL易位染色体；D：株系799，2n=42，含1条1RS-7DS.7DL易位染色体。

图3 CD-13/川麦42 F5群体中部分株系及亲本的醇溶蛋白A-PAGE分析1：蓬安白麦子；2：秦岭黑麦；3：CD-13；4：川麦42。

进一步利用黑麦1RS染色体上的特异分子标记及编码黑麦碱的Sec-1位点的特异标记，对含有1RS染色体臂或片段的15个株系及亲本进行基因型分析。结果发现，对分子标记IB267，15个系均有250 bp条带，蓬安白麦子和川麦42则无扩增产物(图4，表3)；编码黑麦碱的Sec-1位点的SEC-1和SEC-1b标记以及IAG95等9个分子标记，仅765、799和811及亲本蓬安白麦子、川麦42无扩增带，其他12个系和亲本秦岭黑麦、八倍体小黑麦CD-13均有扩增带(图4，表3)。由此表明，765、799和811与蓬安白麦子和川麦42一样，编码黑麦碱蛋白的Sec-1位点缺失，且1RS-7DS.7DL染色体中小片段易位的断裂点在1RS染色体端部标记IB267-IAG95之间(图5)。

2.4 小片段易位对千粒重的影响

2012、2013两年千粒重分析发现，CD-13、秦岭黑麦和蓬安白麦子千粒重较低，分别为23.2 g、23.9 g、27.3 g，川麦42千粒重较高，为48.0 g；13个携带1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位染色体的株系平均千粒重变幅在37.0-51.5之间(表4)，均高于CD-13。含有1对1RS-7DS.7DL染色体的纯合易位系811平均千粒重为47.8 g，远远高于CD-13，与川麦42千粒重差异不显著；仅含有1条1RS-7DS.7DL染色体的2个株系765和799平均千粒重分别为48.3 g、51.5 g，比川麦42分别增加0.3 g、3.5 g；而既含有1RS-7DS.7DL染色体，又含有7DS-1RS.1RL染色体的株系千粒重普遍较低(表4)。由此表明，1RS-7DS小麦–黑麦非部分同源小片段易位对千粒重无负作用。

表3 含有1RS染色体片段的15个株系及其亲本的DNA标记和SEC1蛋白检测

图4 CD-13/川麦42 F5群体中部分株系1RS染色体及编码黑麦碱Sec-1位点的特异标记PCR扩增产物分析1：蓬安白麦子；2：秦岭黑麦；3：CD-13；4：川麦42。

图5 1RS-7DS.7DL小片段易位染色体在1RS染色体上的断裂点标记在1RS染色体臂上的位置根据前人的图谱[34,38,39]。染色体左边为标记，右边箭头所示为断裂点的位置。

3 讨 论

目前，黑麦的许多抗病、抗逆、高产和广适等优异基因已转移到栽培小麦中，育成的携带小麦–黑麦易位的小麦品种已大面积推广和育种应用[7~13]。但是，已鉴定出的小麦–黑麦易位类型中，有关1RS-7DS易位类型的报道较少。亓增军等[43,44]利用染色体C带和FISH技术鉴定六倍体普通小麦矮孟牛种质资源时，发现矮孟牛II、IV、V、VI型携带一种新型的1RS.7DS和1BL.7DL复杂易位，这种复杂易位是在普通小麦杂交过程中，1RS.1BL易位染色体与小麦7D染色体发生相互易位产生的，其1RS来源于黑麦Petkus，易位类型为着丝粒断裂的易位。Masoudi-Nejad等[34]利用杀配子系统将1RS小片段导入了小麦7D染色体，创制了不含黑麦碱基因的1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位系，其1RS小片段来源于黑麦Imperial。本研究1RS-7DS.7DL易位染色体也不含黑麦碱基因，其断裂点在1RS染色体臂端部IB267-IAG95标记区间；该易位染色体中的1RS小片段来源于秦岭黑麦，与前人创制的1RS-7DS.7DL小麦–黑麦小片段易位系以及我国目前广泛使用的1RS及1RS.1BL易位系的来源均不同。

表4 含有1RS-7DS.7DL小片段易位染色体株系的千粒重比较

本研究获得的八倍体小黑麦CD-13结实率90%以上，育性较好，穗子长，穗粒数多，但千粒重低；经多年白粉病和条锈病鉴定发现，高抗白粉病、成株期高抗条锈病，其抗病基因的来源与位置正在深入研究。2012和2013年连续两年对CD-13/川麦42 F5群体及其亲本进行千粒重测定，发现纯合易位系811平均千粒重为47.8 g，远远高于CD-13，与川麦42千粒重差异不显著；仅含有1条1RS-7DS.7DL染色体的2个株系(765和799)平均千粒重比川麦42分别增加0.3 g和3.5 g；而既含有1RS-7DS.7DL染色体，又含7DS-1RS.1RL染色体的株系千粒重普遍较低，可能是受7DS-1RS.1RL染色体的影响。前人研究表明1RS染色体携带大量提高产量、产量构成因子及环境适应性的基因[15,18]，其端部大约15%的片段也携带大量与生根能力和根的形态学性状相关的基因[45]。本研究创制的纯合1RS-7DS.7DL易位系(811)中的1RS端部小片段对千粒重无负作用，但其是否也携带可提高产量，增加根生物产量等基因，需进一步研究证明。

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(责任编委:夏先春)

Identification of the 1RS-7DS.7DLwheat-rye small segment translocation lines

Jun Li1,Xinguo Zhu1,2,Hongshen Wan1,Qin Wang1,Zongxiang Tang2,Shulan Fu2, Zujun Yang3,Manyu Yang1,Wuyun Yang1

1.Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding in Wheat(Southwest)of Ministry of Agriculture,Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;
2.Key Laboratory of Plant Breeding and Genetics,College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Wenjiang 611130,China;
3.School of Life Science and Technology,University of Electronic Science and Technology of China,Chengdu 610054,China

Rye(Secale cereale L.,RR)is a valuable genetic resource for the improvement of common wheat (Triticum aestivum L.,AABBDD).Transferring alien ryegenesinto wheatby distanthybridization and automatic chromosome doubling is an important and efficient method to boost agronomic traits,disease resistance and widening the gene pool in wheat.In this study,an octoploid triticale CD-13(AABBDDRR)was obtained via automatic chromosome doubling by crossing landrace Penganbaimaizi(T.aestivum L.,AABBDD)and rye“Qinling rye”(S.cereale cv.Qinling,RR).GISH and FISH analyses indicated that CD-13 contained a 1RS-7DS.7DL wheat-rye small segment translocation chromosome.In order to transfer the 1RS-7DS small segment translocation into hexaploid wheat,58 lines of the F5inbred population from the cross CD-13 x Chuanmai 42 were screened for rye chromosome segments by GISH and FISH analyses.The results showed that 13 lines contained the 1RS-7DS.7DL small segment translocation chromosome by reciprocal translocation between 1RS and 7DS.These translocation lines carrying 1RS small rye alien segment were tested for the translocation breakpoints and the presence of a storage protein locus Sec-1.The Sec-1 locus was absent in the line 811,a stable 1RS-7DS.7DL small segment translocation line.The translocation breakpoint of 1RS-7DS.7DL of this line was located in the interval of IB267-IAG95 around the telomere of 1RS chromosome.Thousand-kernel weight of the line 811 was much higher than the parent CD-13,but not significantly different from Chuanmai 42.This indicated that 1RS-7DS.7DL small segment translocation had no negative effect on thousand-kernel weight in the genetic background of Chuanmai 42.The line with 1RS-7DS.7DL translocation chromosomes can be used as a new genetic material for further studies of valuable genes and their genetic effect on 1RS small segment.

wheat;rye;1RS-7DS.7DL;small segment translocation

2014-10-19;

2015-03-06

国家科技支撑计划项目(编号：2013BAD01B02-7)，四川省科技计划项目(编号：2011NZ0098-16，2014TD0014)和四川省财政基因工程项目(编号：2011QNJJ-007)资助

李俊，博士，副研究员，研究方向：小麦资源创制与遗传育种。Tel:028-84504259；E-mail:lijunchd@126.com

朱欣果，硕士，研究方向：作物推广。E-mail:zhuxingguo5299@126.com

李俊和朱欣果为并列第一作者。

杨武云，博士，研究员，研究方向：小麦遗传育种。E-mail:yangwuyun@126.com

10.16288/j.yczz.14-358

时间:2015-3-26 10:12:13

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150326.1012.004.html