凉血解毒方药对原发免疫性血小板减少症患者外周血CDCD调节性T细胞水平的影响

刘清池 王淑珍 冯寿岐 马传宝 张振会 王荣孝 熊建军 庞宇慧 张慧敏

原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种因免疫失衡导致血小板破坏加速的出血性疾病，以血小板数量减少和皮肤黏膜出血为主要表现，严重时可引起内脏出血甚至死亡［1-3］。目前该病发病确切机制尚不明确，一般认为与患者机体免疫功能失调、免疫细胞功能紊乱有关。机体免疫失衡，产生自身血小板抗体，自身抗体致敏的血小板被单核巨噬细胞系统过度吞噬破坏，以及免疫失衡导致骨髓巨核细胞产血小板障碍，是ITP发病的主要机制［4］。近年来研究显示机体免疫耐受被打破，自身反应性T、B细胞异常激活(即细胞免疫异常)也参与了ITP的发生。CD4+CD调节性T细胞(regulatory T cells，CD4+CD)是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能抑制T、B细胞的活化、增殖及自身抗体的产生，维持机体免疫耐受，阻止自身免疫性疾病的发生［5］。许多研究表明ITP患者CD4+CD细胞表达下降，在ITP免疫学发病机制中起着重要作用［6-8］。我们通过流式细胞仪检测ITP患者凉血解毒方药治疗前和治疗后CD4+CD调节性T细胞水平变化情况，初步探讨凉血解毒方药治疗ITP对CD4+CD调节性T细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年3月至2013年3月河北省石家庄平安医院血液科门诊及住院患者56例为治疗组，其中男12例，女44例;年龄18～62岁，中位年龄29岁;病程0.5～60个月，中位病程21个月;新诊ITP患者5例，持续ITP患者11例，慢性ITP患者15例，重症ITP患者23例，难治ITP 2例;其中初治患者5例，复治患者51例［均有糖皮质激素或其他免疫抑制剂应用史，停药或减量后复发，来诊时血小板值(13.04±11.2)×109/L］。ITP诊断及分型标准按照文献［1］诊断:(1)至少2次实验室检查血小板计数减少，血细胞形态无异常;(2)脾脏一般不增大;(3)骨髓检查巨核细胞数量增多或正常、有成熟障碍;(4)排除其他继发性血小板减少症，如自身免疫性疾病、甲状腺疾病、药物诱导的血小板减少、同种免疫性血小板减少、淋巴系统增殖性疾病、骨髓增生异常［再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)］、恶性血液病、慢性肝病脾功能亢进、血小板消耗性减少、妊娠血小板减少、感染等所致的继发性血小板减少、假性血小板减少以及先天性血小板减少等。本研究获得河北省石家庄平安医院伦理委员会批准。选择20例健康体检者为对照组，其中男12例，女8例;年龄22～55岁，中位年龄32岁;均无自身免疫异常性疾病和肿瘤性疾病。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:凡符合ITP诊断标准［1］，年龄14岁以上，于2012年3月至2013年3月在石家庄平安医院就诊并签署知情同意书的患者。

1.2.2 排除标准:有下列条件之一者不能入选本研究:有严重内脏出血者;有显著心理障碍者;严重肝功能障碍者;严重肾功能障碍者;不能服用中药者;拒绝签署知情同意书者。

1.3 剔除与脱落病例标准 (1)未按规定治疗，无法判断疗效者;(2)资料严重不全影响疗效或安全性判断者;(3)治疗过程中发生意外事件而不能坚持治疗者;(4)治疗过程中不配合治疗者;(5)在观察期内失访的患者。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法:入选病例给以凉血解毒方药治疗，地黄止血胶囊(河北省石家庄平安医院，冀药制字Z20050758，药物组成:生地、茜草、丹皮、水牛角、太子参、三七等制成0.4 g/粒的胶囊)2 g，3次/d，并配合应用自拟方“升板汤”，方药组成:紫珠、炒栀子、鹿茸草、紫草、地锦草、连翘、卷柏、山药，1剂/d，每剂水煎煮2次，共取药汁300 ml左右，分早晚2次温服。治疗观察3个月。有明显出血者辅以氨甲环酸、酚磺乙胺等止血药物，PLT＜10×109/L和并伴活动性出血的患者，给予人血丙种球蛋白输注。

1.4.2 标本采集:ITP患者治疗前1 d和治疗第90天于清晨空腹采集外周静脉血2 ml(EDTA抗凝)。20例健康成人外周血标本由我院体检中心同法采集。

1.4.3 仪器与主要试剂:所用流式细胞仪为 BD FACSCanto II型，分析软件为Cell Quest，均为美国BD公司产品。异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗人IgG单抗、FITC标记的鼠抗人CD4单抗、藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD25单抗及溶血素均购自美国BD公司，pH值7.2磷酸盐缓冲液(PBS)由本实验室配置。

1.4.4 CD4+CD调节性T细胞水平检测:取抗凝全血5μl，分别加入5μl FITC标记的CD4抗体、PE标记的CD25抗体，室温避光孵育15 min，加入溶血剂500μl，混匀后室温避光孵育15 min，380×g离心5 min，弃上清，加入PBS 2 ml洗涤后，380×g离心5 min弃上清，加入PBS 500 ml悬浮细胞，上机检测。数据采用Cell Quest软件进行分析。

1.4.5 疗效判定:①完全缓解(CR):PLT≥100×109/L且无出血;②有效:PLT≥30×109/L或较基线水平增长＞2倍且无出血;③无效:PLT＜30×109/L者较基线水平上升＜2倍或有出血。

1.5 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP患者与正常对照组CD+4CD调节性T细胞水平比较 治疗组治疗前外周血CD4+C细胞水平［(1.01±0.67)%］低于正常对照组［(2.81±0.52)%］，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。2.2 ITP患者治疗前后外周血CD4+CD调节性T细胞水平比较 治疗第90天患者CD4+CD调节性T细胞水平［(1.93±0.53)%］高于治疗前［(1.01±0.67)%］，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 ITP患者治疗后CD4+CD调节性T细胞水与对照组比较 治疗第90天CD4+CD调节性T细胞水平仍低于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 流式细胞术检测ITP患者凉血解毒方药治疗前后CD4+CD调节性T细胞水平%，±s

表1 流式细胞术检测ITP患者凉血解毒方药治疗前后CD4+CD调节性T细胞水平%，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与治疗前比较，#P ＜O.05

组别 治疗前 治疗后治疗组(n=56) 1.01±0.67* 1.93±0.53*#对照组(n=20)2.81±0.52 -

表2 3组CD4+CD调节性T细胞水平%，±s

表2 3组CD4+CD调节性T细胞水平%，±s

注:与无效组比较，*P＜0.05

细胞有效组(n=41) 2.38±0.61组别 CD+4 CD+25调节性T*无效组(n=15) 1.51±0.73对照组(n=20) 2.81±0.52*

2.5 重症ITP与非重症ITP患者CD+4CD调节性T细胞水平比较 重症ITP患者CD+4CD调节性T细胞水平低于非重症患者(P＜0.01)。见表3。

表3 重症ITP与非重症ITP患者CD+4 CD调节性T细胞水平

表3 重症ITP与非重症ITP患者CD+4 CD调节性T细胞水平

注:与非重症组比较，*P＜0.01

%，±s细胞重症ITP(n=23) 0.71±0.23组别 CD+4 CD+25调节性T*非重症ITP(n=33)1.48±0.64

3 讨论

ITP发病机制目前尚未完全明确。近年来研究提示，T细胞异常可能起主导作用，异常活化的T细胞，一方面抑制骨髓巨核细胞血小板的产生，一方面激活B细胞产生针对血小板的自生抗体［4，9］。而T细胞的活化受CD4+CDT细胞的调节，其数量减少、免疫抑制功能的减弱、抑制性细胞因子(IL-10、TGF-B等)分泌减少，减弱了其对T辅助细胞(Th cell)的抑制功能，T、B细胞异常活化，产生针对血小板表面糖蛋白的自身抗体，使血小板的破坏加速，并抑制巨核细胞的产板功能，从而导致ITP的发生。因此，CD+4CD调节性T细胞异常与 ITP 发病密切相关［10，11］。

我们采用流式细胞技术对56例ITP患者及20例正常对照者外周血CD4+CDT细胞进行检测，发现ITP患者CD4+CD调节性T细胞比例明显低于对照组，应用凉血解毒方药治疗后其CD4+CD调节性T细胞比例上升，明显高于治疗前，与我们以往研究［12］基本一致。国内蒋磊等［13］选取35例成人急性自身免疫性血小板减少性紫癜患者作为试验组，20例健康正常人为对照组，采用流式细胞技术检测试验组和对照组的外周血中CD4+CD调节T细胞表达率，结果试验组明显低于正常对照组，并且试验组和对照组外周血中CD4+CD调节T细胞表达率与血小板计数呈正相关，换言之，ITP患者CD4+CD调节T细胞表达率越低其血小板计数也越低。张蓝方等［14］检测了41例ITP患者和41例健康查体者的CD4+CD调节性T细胞水平，结果ITP病例组外周血CD4+CD调节T细胞的百分率明显低于正常对照组，治疗后CD4+CD调节性T细胞水平上升。李振宇等［15］报道新诊断ITP患者的调节性T细胞水平明显低于正常对照，治疗后上升。我们的研究结果基本与上述研究报道一致。这些研究结果提示CD4+CD调节性T细胞水平降低参与了ITP的发病与转归。另外，我们此次研究发现重症ITP患者CD4+CD调节性T细胞水平明显低于重症患者，说明CD4+CD调节性T细胞水平与疾病严重程度相关，提示重症患者免疫功能状态紊乱程度更加严重。本组ITP患者应用凉血解毒方药治疗总有效率73.2%(41/56)，治疗后有效组CD4+CD调节性T细胞水平高于无效组，差异有统计学意义，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明患者随着CD4+CD调节性T细胞水平的恢复血小板数量也增加，疾病趋于恢复。提示CD4+CD细胞在ITP发病中可能发挥重要作用，凉血解毒方药治疗对ITP患者CD4+CD调节性T细胞水平有调节作用，有助于部分ITP患者CD4+CD调节性T细胞水平恢复正常水平，促进疾病的恢复。一部分患者应用凉血解毒方药治疗无效，且其CDCD细胞水平也无恢复，提示ITP免疫紊乱机制的复杂性。

国内研究者通过体外实验探讨了部分凉血解毒、凉血止血中药对免疫功能的影响。沈红等［16］研究提示清热解毒中药连翘的主要活性提取物连翘酯苷可通过影响小淋巴细胞增殖和细胞因子分泌而调节免疫细胞功能;王建杰等［17］研究发现凉血中药丹皮的活性成分丹皮酚通过调节 T细胞亚群比例，修复CD4+/CD8+比值，改善了 EMT6乳腺癌小鼠的免疫功能;敖亮等［18］发现清热凉血中药生地的水提取物对小鼠的体液免疫和和细胞免疫功能均有调节作用;米克热帕·阿布都买买提等［19］研究显示清热凉血中药紫草水提部位能显著增加免疫低下小鼠的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分含量，增高CD4+/CD8+比值，降低CD8+T淋巴细胞的百分含量;综合近期对凉血止血药在对机体免疫功能影响的文献显示，三七具有双向免疫调节功能，既可以通过提高免疫T细胞活性来发挥免疫增强作用，又可以通过抑制一些炎性细胞因子如IL-6、IL-4等的产生发挥免疫抑制作用［20-23］。这些现代药理学研究的体外实验揭示凉血解毒、凉血止血中药具有调节机体T细胞免疫功能的作用。

本研究证实临床应用凉血解毒方药治疗ITP有效，其疗效机制可能与调节机体免疫，特别是促进CD4+CD调节性T细胞水平恢复正常有关，可作为中医治疗ITP的推荐治疗方案。

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