重组金黄色葡萄球菌肠毒素B对禽流感灭活苗的佐剂作用研究

周晓芬等

摘要：利用大肠杆菌的原核表达体系高效表达SEB基因，获得了SEB重组蛋白（rSEB）；通过优化SEB较好发挥免疫效果时的免疫剂量，选取5 μg/只SEB分别协同AIV-H9/NDV二联灭活苗和AIV-H5灭活疫苗对2周龄的艾维因肉鸡进行免疫，定期测定HA抗体滴度及淋巴细胞活性以评价SEB的免疫增强效果。结果表明，SEB免疫组的NDV和AIV的HA抗体效价显著高于疫苗对照组（P<0.05），rSEB中剂量组（5 μg/只）佐剂效果明显（P<0.05）；SEB协同免疫组的淋巴细胞活性在免疫后第15 天达到峰值，随后逐渐下降，至第25天与疫苗对照组相比，差异仍然显著（P<0.05）。

关键词：SEB；佐剂；疫苗；肉鸡

中图分类号：R378.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4245-05

金黄色葡萄球菌产生的耐热性肠毒素B（Staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB），是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的常见原因，因此，这方面的研究已成为科学家们普遍关注的重要课题。然而，作为一种超抗原，SEB具有强大的淋巴细胞丝裂原潜力，只需极低浓度（0.1 ng/mL）即可刺激强烈的免疫应答，不仅活化大量的T淋巴细胞，同时释放众多细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α），而且可非特异性提高特异性抗原的免疫原性[1-4]。因此，SEB具备成为免疫佐剂的潜力。有研究发现，SEB不仅能增强B16F10 黑色素瘤弱抗原的免疫原活性，其效率可达25倍以上，而且免疫小鼠的保护率高达75%以上，保护期长达170 d以上[5]；而且SEB对T细胞依赖抗原BSA和HIV-gp120和Ⅱ型T细胞非依赖抗原——肺炎球菌脂多糖具有非特异性免疫增强作用[6]。在野生型小鼠中，鼻腔内给予OVA+SEB能诱导肺部炎症，重要表现之一是OVA特异性IgE增加[7]。尽管SEB的佐剂活性在医学领域有一定的认识，但目前在国际兽医领域涉足极少，需要做大量的工作。本研究通过动物试验首次研究rSEB作为禽流感疫苗免疫增强剂，通过检测免疫鸡群血清中HA抗体水平和外周血淋巴细胞增殖能力，以此评价SEB作为免疫佐剂的效果，为进一步深入开发利用SEB潜力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

表达菌株pET28a-SEB由本实验室保存。1日龄非免疫艾维因肉鸡购自武汉正大有限公司， 饲养至2周龄进行随机分组隔离饲养管理；禽流感H9+NDV二联灭活苗和H5灭活疫苗为黑龙江省生物制品一厂生产；AIV和NDV血凝素抗原从哈尔滨兽药研究所购买；标准SEB（sSEB）及其阳性血清购自中国军事医学科学院。

1.2 试验方法

1.2.1 pET28a-SEB表达质粒的鉴定与表达 将表达pET28a-SEB的DH5α菌株，于37 ℃培养过夜后，提取质粒DNA，用BamH I和XholI酶切，并将表达菌株送上海生物工程公司测序。取测序正确的pET28a-SEB质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），涂布含Amp的LB平板37 ℃培养过夜。挑取单菌落进行扩大培养，当培养物A600 nm为0.6～0.8时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养4～5 h，收集菌体。经超声波破碎后，离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE和Western Blot检测。Western Blot检测时，一抗为1∶1 000的SEB阳性血清，二抗为1∶5 000兔抗鼠IgG-HRP，显色为TMB。

1.2.2 pET28a-SEB 包涵体的变性和复性及纯化参考文献[4]。纯化蛋白质样品用紫外分光光度计测定OD260 nm和OD280 nm值，蛋白质含量计算：蛋白质浓度（mg/mL）=（1.45×A280 nm-0.74×A260 nm）×稀释倍数。将纯化物分装冻干保存，以备动物试验。

1.2.3 动物试验

1.2.3.1 SEB佐剂效应试验 将105只14日龄肉鸡随机分成7组，每组15只。第1组到第5组肌肉注射AIV-H9/NDV灭活疫苗0.3 mL/只，同时腹腔注射不同剂量的SEB，其中sSEB试验组设高、中和低3个剂量，分别为1.0 μg/只、10 ng/只和1.0 ng/只；rSEB试验组设置2个剂量，分别为1.0 μg/只和10 ng/只；第6组肌肉注射AIV-H9/NDV灭活疫苗0.3 mL/只同时腹腔注射生理盐水；第7组设为空白对照组。

1.2.3.2 rSEB较优剂量选择试验 将90只14日龄肉鸡随机分成6组，15只/组，前5组肌肉注射AIV-H9/NDV灭活疫苗0.3 mL/只，第6组为空白对照组。其中第1组到第4组同时腹腔注射不同剂量的SEB，其中sSEB试验组每只注射1.0 μg标准SEB；rSEB试验组设置高、中、低3个剂量组，剂量分别为10.0 μg/只，5.0 μg/只和1.0 μg/只；第5组注射生理盐水；第6组为空白对照组。

1.2.3.3 rSEB增强AIV-H5灭活疫苗免疫效果 将60只14日龄艾维因肉鸡随机分成4组，15只/组。第1至3组肌肉注射AIV-H5灭活疫苗0.3 mL，同时分别腹腔注射生理盐水、5.0 μg/只rSEB和pET-28a转化大肠杆菌裂解物上清液，第4组注射生理盐水0.3 mL/只为空白对照组。

1.2.3.4 试验动物处理 各试验组在免疫后每天定时观察活动状态，在免疫后第7、14、21和28天翅静脉采血，进行HI试验测定HA抗体水平；同时分别收集免疫后第3、5、10、15、20和25天血液淋巴细胞进行MTT试验[8]，测定淋巴细胞增殖。

1.2.4 统计学处理 数据处理测定结果以平均数和标准差表示，用t检验分析试验组和对照组、差异的显著性，并做相关性分析。P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 pET8a-SEB的鉴定

由图1可知，pET28a-SEB经BamHI和XholI 双酶切后，得到大小为750 bp左右的目的片段。核苷酸测序结果，目的片段大小为720 bp，与PM36株的SEB基因核苷酸序列同源性达100%。

2.2 表达产物SDS-PAGE 和Western Blot检测

SDS-PAGE结果显示，转化pET28a-SEB质粒的BL21（DE3）经IPITG诱导后成功地表达seb基因，重组蛋白分子量约为31 kDa，与预期结果一致。重组蛋白主要以包涵体形式存在，其表达量占沉淀总蛋白42%左右（图2）；未经IPTG诱导的菌未出现明显的目的蛋白质条带；而转化pET28a质粒的BL21（DE3）无特异条带。Western Blot结果显示，在约31kDa处出现一条特异性反应条带（图3），说明纯化复性后的rSEB包涵体蛋白质能够被SEB阳性血清识别，其抗原性良好。

2.3 SEB佐剂效应试验

各试验组内的鸡群在免疫前后的采食、活动及精神状态没有明显变化。对鸡群定期采集血清和分离血液淋巴细胞，分别进行HI和MTT试验，以评价肉鸡的体液免疫和细胞免疫状态。表1、表2和表3显示，sSEB或rSEB免疫组的二者指标与免疫剂量呈正相关，与疫苗对照组和空白对照组的结果相比较，差异显著（P<0.05）；其中疫苗+1.0 μg/只sSEB组具有显著的免疫增强作用，与其他各组差异显著（P<0.05）；sSEB免疫增强作用比同等剂量的rSEB的作用强。

2.4 rSEB佐剂剂量选择试验

由表4、表5和表6数据显示，5 μg/只rSEB组在免疫第2周后的抗体水平和淋巴细胞活性比其他各组同期的结果都高，而一定剂量sSEB的佐剂作用显著高于同等剂量rSEB的佐剂效果（P<0.05）；高剂量rSEB（10.0 μg/只）在免疫初期1～2周的HA抗体滴度和淋巴细胞活性快速提高，但随后无明显变化，低于其他各试验组。

2.5 rSEB增强AIV（H5）灭活疫苗免疫效果

在整个试验过程中，以rSEB+AIV（H5）灭活疫苗免疫组的抗体效价比AIV（H5）灭活疫苗免疫组的抗体效价高，二者差异显著（P<0.05）；AIV（H5）灭活疫苗和PET-28a转化大肠杆菌裂解物免疫组与疫苗免疫组抗体效价效价相当，无明显差异（表7）。这进一步说明，SEB在与其他疫苗抗原同时使用时起到了免疫增强作用。

3 讨论

SEB具有多种生物学功能[9]，但基于生物安全和食物中毒潜在风险，SEB的实际应用多受限制，尤其是在兽医应用领域鲜见报道。许多研究发现，SEB具有双相激活作用的机制，即高剂量时诱导迅速，随之出现反应不应期，而在低剂量时，则诱导长期而持续的激活状态[10，11]。在本研究的过程中，发现合适的剂量0.01～10 μg rSEB均具有佐剂效应，然而过高剂量的SEB（>10 μg/只）引起了一定程度的免疫抑制。这一现象与其他研究者的结果基本一致。俞红等[12]用纯化的重组SEB蛋白进行小鼠脾细胞淋转试验证明，10 μg/mL浓度的SEB刺激淋转的能力最大；当浓度达20 μg/mL或以上时，淋转受到抑制，且浓度越高，抑制越严重。魏萍[13]研究了SAg-SEB和MDV诱导雏鸡与荷瘤小鼠免疫学变化及细胞凋亡情况，结果也显示SEB存在双向激活作用。SEB的双相作用存在暴露剂量的依赖关系，可能原因是SAg刺激T细胞数量有一阈值存在。

虽然在整个动物试验过程并未发现0.01～10 μg的SEB对鸡群造成肉眼可见病变，但SEB带来的生物安全性问题不容忽视。国外早期的研究表明，小鼠给予SEB后导致毒素体内分布的峰值出现于1 h之后，至24 h后毒素消失；即使给予BALB/c小鼠SEB100 μg/只，3～4 d后小鼠会开始恢复健康[14]。这说明SEB在动物体内停留的时间不长，能被快速代谢而降解。尽管还不清楚SEB在肉鸡体内的代谢规律，但是有研究者曾研究金黄色葡萄球菌超抗原家属另一成员SEA在肉鸡体内的代谢规律，研究结果表明肌肉注射200 μg rSEA甚至更高剂量后肉鸡并没出现明显异常表现，7 d后检测不到SEA残留[15]。而且关于SEB对鸡体的病理损害，国内已有报道[16]，但其涉及SEB剂量为50 μg/只标准SEB，这一剂量是本试验剂量的10倍以上。将为下一步进行SEB对鸡体的毒理和病理试验提供了借鉴。同时借助SEB-ELISA检测试剂进一步了解SEB在鸡体内的代谢动力学规律和安全剂量，为安全利用SEB奠定基础。此外，本试验对SEB结构进行合理改造，减少甚至消除其毒副作用，充分发挥其超抗原优势，促进其在兽医科学上应用领域。

试验结果表明，适量SEB具有良好的佐剂活性，不仅能协助禽流感和新城疫等免疫抗原诱导机体产生快且强的体液免疫，同时也能激活细胞免疫，进而增强鸡体抗病能力。适量rSEB作为强有力的T细胞激活抗原，具有强大的佐剂潜力，如能合理利用其超抗原优势，SEB在预防兽医领域将具有重要的开发应用价值。

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