马兜铃酸检测技术的研究进展

田 梦，瞿俊勇，马 慧，张明军

（1. 湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2. 湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙410127）

马兜铃酸（Aristolochic Acid，AA）是自然界中发现的第一种含硝基化合物，由3,4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生而来。马兜铃属植物种类繁多、品种丰富。目前，已知品种超过了450种，而我国范围内发现有56种以上，且在各地均有分布，以西南及南部地区最多[1]。长期以来，含马兜铃酸的中草药被广泛应用于各种疾病的防治领域，但随着临床应用增多以及试验研究的不断深入，马兜铃酸的各种副作用和毒性被相继报道出来[2]。于是，建立稳定、可重复的马兜铃酸类物质检测体系十分必要。目前，马兜铃酸的分析检测方法主要有薄层层析法、薄层扫描法、极谱法、HPLC法、荧光分析法、气相色谱分析法、TLC-UV 分光光度法和二阶导数光谱测定法等[3]。

1 马兜铃酸的分子结构

马兜铃酸的结构特点是C-1 有羧基，C-3、C-4 有次甲二氧基，见图1。目前，已发现天然存在的马兜铃酸有A、B、C、D、E，7-甲氧基马兜铃酸，7-羟基马兜铃酸等，见图2。对马兜铃酸类物质的结构分析主要通过光谱解析，特别是氢核磁共振波谱法（1H-NMR）。由于该类型化合物的质谱有较强的分子离子峰，因此很容易通过质谱方法推定其分子式，再根据其基本母核通过1H-NMR 芳香质子的解析，结合必要的去偶实验，就可推定各个芳香质子的位置，从而确定其结构。

图1 马兜铃酸的分子结构式

2 马兜铃酸的检测方法

2.1 高效液相色谱法

图2 不同类型天然马兜铃酸分子的特殊基团

近年来，高效液相色谱法作为一种稳定、可靠、高效的分析方法，在中药材成分研究领域被广泛使用，特别是对于成分差别细微的单味中草药以及成分极为复杂的中药复方制剂的鉴别领域。该方法的分离鉴别能力大大优于其他鉴定方法，且具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、准确、重现性好等优点。

2.1.1 药材及中药组合中马兜铃酸类成分测定 葛孝忠等[4]建立了HPLC 法测定辛芩颗粒中马兜铃酸A的限度，检测出马兜铃酸A 在细辛药材和细辛颗粒中的回收率为98.1%和98.34%。吴艳蓉等[5]采用HPLC法对不同产地辽细辛种子以及果实中不同部位中的马兜铃酸A 含量进行了检测，结果显示辽细辛果实各部位中均含有马兜铃酸A，其中以种子中的含量最高，而不同产地辽细辛种子中马兜铃酸A 的含量有较大差异。韩娜等[6]采用RP-HPLC 法对14种中药材中的马兜铃酸A 进行含量测定，结果显示广西山慈菇、短尾细辛、万源山慈菇、苕叶细辛、关木通、寻骨风、川细辛、宜宾防己、淮通、广元防己这10种中药材中马兜铃酸A 的含量分别为0.13、0.15、0.18、0.22、0.49、0.52、0.58、0.72、0.94、3.00 mg/g，而平昌防己、冕宁防己、穆平马兜铃、北细辛这4种中药材的地上及地下部分中均未检出马兜铃酸A。王亮等[7]采用RP-HPLC法测定了不同剂量竹叶配伍关木通中马兜铃酸A 的溶出量，结果表明关木通中马兜铃酸A 的溶出量为0.106 mg/m L；竹叶与关木通以1∶4 的比例配伍，马兜铃酸A 的溶出量为0.041 mg/m L。

2.1.2 中成药中马兜铃酸类成分测定 全世建等[8]采用RP-HPLC 法对关木通和龙胆泻肝汤中各拆方组进行马兜铃酸A 测定，以观察其变化趋势，从而探讨不同中药配伍对马兜铃酸A 含量的影响。结果表明，与关木通相比，龙胆泻肝汤的全方组中马兜铃酸A 的含量最低。倪琳等[9]用HPLC 法对五味渣驯丸中主要成分马兜铃酸A 进行定量分析，结果显示，马兜铃酸A的线性范围为0.024～0.247 μg（r=0.999 99），平均回收率为96.83%，相对标准偏差1.74%。叶志斌等[10]用HPLC 法测定了纯阳正气丸清宁丸、川芎茶调丸、龙胆泻肝丸和关木通药剂这4种中成药中马兜铃酸A 的含量，结果发现，在同等条件下进行提取，关木通水煎剂中马兜铃酸A 的含量仅相当于甲醇提取液中的1/3；而川芎茶调丸、青宁丸和龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A 含量很低，关木通粗粉中马兜铃酸A 含量平均为0.23%。唐秀玲等[11]通过萃取、过固相萃取小柱对消肿止痛酊中马兜铃酸A 进行提取纯化，应用HPLC 法对其进行检测，结果表明，该方法可有效提取消肿止痛酊中的马兜铃酸A，同时该方法简便快捷、重复性好、结果准确可靠，可作为控制消肿止痛酊安全性的检测方法。陈娜娜等[12]采用超声、固相萃取法对辛芩胶囊中马兜铃酸A 进行提取纯化，在利用HPLC 法测定其含量，结果显示，该方法简便快捷、结果准确可靠，可用于辛芩胶囊中马兜铃酸A 的限量检查。刘雅琳等[13]建立了马兜铃酸A 微量检测体系，对目前使用的含马兜铃酸A 的中草药材以及易与含马兜铃酸药材混淆的中草药材和中成药进行检测，结果表明该方法重复性好、灵敏度高，可用于含微量马兜铃酸A 中草药材或中成药限量检测。阮叶萍等[14]采用RP-HPLC法，测定当归四逆汤中各组分的马兜铃酸A 含量，发现当归四逆汤全方中的马兜铃酸A 含量最低，关木通+补血组中的马兜铃酸A 含量也较低。

2.2 其他检测方法

超高效液相色谱- 串联质谱检测法（HPLCMS/MS）是一种分析速度快、定性准确的检测方法，已在中药质量控制、中药药代动力学研究、中药化学成分分析以及中药代谢研究中广泛使用。刘萤等[15]利用超高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱仪建立了中药中马兜铃酸A 和B 的定性定量分析方法，结果表明该方法灵敏度高、重复性好、操作简便，适用于中药材/饮片及中成药中马兜铃酸A 和B 的痕量检测。周围等[16]建立了中成药中马兜铃酸A 的超高液相色谱-质谱检测方法，测定结果表明，马兜铃酸A 在超高压液相色谱-质谱的选择离子记录（SIR）中有较强的分子离子峰，检出限为0.1 mg/kg，可以满足中成药中对马兜铃酸A 的测定要求。季文萱等[17]通过酶活化法和化学活化法使马兜铃酸A 与脱氧腺苷酸反应合成马兜铃酸A-DNA 加合物，优化各种反应条件后，利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对合成的马兜铃酸A-DNA 加合物进行结构鉴定，发现马兜铃酸A活化后能与腺嘌呤形成马兜铃酸A-DNA 加合物，LC-MS/MS 技术能够快速方便准确地检测马兜铃酸A-DNA 加合物。

紫外可见分光光度法是根据物质分子对波长为200～760 nm 这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。该方法主要依据物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度来测量物质浓度。由于不同浓度的吸收光谱不同，可获得不同吸收光谱的曲线，同时吸收峰数值与浓度成正比关系，从而通过峰数值来确定物质的浓度。该方法操作简单、准确度高、重现性好，应用范围较广。刘学湘等[18]采用反向HPLC 二元梯度洗脱法提取13种青木香发酵品中的马兜铃酸A，并采用紫外分光光度法测定这些发酵品中的总马兜铃酸含量，结果表明各种真菌发酵可在不同程度上降低中药青木香中肾毒性成分马兜铃酸A 和总马兜铃酸的含量。张萍[19]采用紫外分光光度法测定马蹄香不同部位马兜铃酸A的含量，结果表明马兜铃酸A 主要存在于马蹄香的地下根部位；通过不同年份马蹄香植物中马兜铃酸A 的含量比较分析，得出马兜铃酸A 在马蹄香植物内存在比较稳定。

3 结语

越来越多关于马兜铃酸类物质对人体危害性的报道，引起人们对马兜铃酸类物质检测技术的重视。对于已知含有马兜铃酸类物质的药物，人们可以采取措施，弃用该药或采用替代药物，而对于未知的或是怀疑可能含有马兜铃酸类物质的非马兜铃科属的中草药，就可能存在疏忽遗漏。因此，建立一种可靠的方法来检测疑似含有马兜铃酸类物质的中成药和药用植物，对于指导临床采取防范措施以及更合理用药具有重大意义。总结前人的研究成果，笔者认为HPLC法是检测马兜铃酸A 的有效方法，与其他方法相比，具有以下优点：灵敏度高、分辨率高、样品用量少、容易回收；样品经过色谱柱后不会被破坏，可以收集单一组分；速度快，通常一个样品在15～30 min 内即可完成检测。

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