狂犬病疫苗研究进展

江馗语

在全球共有150多个国家和地区存在狂犬病，每年大约有2～6万人死于该病，其中99%发生在亚洲和非洲等发展中国家。有关国际组织已经制定了全球消灭狂犬病的目标路线图，计划到2015年和2020年，分别在拉美国家和东南亚国家消灭人类和犬的狂犬病。国际社会普遍认为，狂犬病是一种100%可通过疫苗预防的疫病，在狂犬病感染国，只要犬的免疫密度能够达到70%，犬狂犬病即可消灭，且人间病例可快速下降至零。我国狂犬病每年发病人数仅次于印度，居世界第二位。因此，我们要实施犬的全面免疫，做好人的暴露后预防工作，加快推进狂犬病的控制以及消灭进程。今年，我省也提到要按照《辽宁省养犬管理规定》要求，组织开展狂犬病免疫工作。现将几种狂犬病疫苗的研究进展分别进行介绍。

一、常规疫苗

目前，狂犬病免疫所用的常规疫苗分为灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。

（一）灭活疫苗 灭活疫苗主要是经灭火剂等灭活生产的组织或细胞培养疫苗。发达国家一直使用灭活疫苗，而我国还没有在犬的免疫预防中推广开来。由于狂犬病灭活疫苗具有安全、高效的优点，从安全的角度考虑，人们越来越倾向于灭活的狂犬病疫苗。近几年，农业部批准的兽用狂犬疫苗有中国兽医药品监察所的Flury株冻干灭活疫苗、解放军军事兽医研究所的CVS-11 株灭活疫苗、辽宁成大的PV2061株灭活疫苗、辽宁益康的 Flury 株灭活疫苗、唐山怡安的CTN1株灭活疫苗、常州同泰的 SAD 株灭活疫苗等。另外，常州同泰生物药业科技有限公司去年正在探索将CVS-11病毒灭活后同SAD病毒液混合后的免疫效果，这也为新型狂犬病灭活疫苗的研制提供了实验基础。

狂犬病灭活疫苗常常配合佐剂使用。目前常用的佐剂有铝胶佐剂、白介素-2（IL-2）、干扰素、PolyIC佐剂、氢氧化锌(Zn(OH)2)、水包油佐剂等。铝胶佐剂成本低廉，安全无毒，但只诱导体液免疫应答，适用于以抗体保护为主的疾病疫苗，且在注射部位缓慢释放抗原的效应较低，作用较慢，产生的中和抗体较迟。有研究表明，与铝佐剂疫苗和无佐剂疫苗相比，IL-2佐剂疫苗诱导产生中和抗体的时间早，抗体滴度高，疫苗具有良好的免疫学效果。王忠海的研究表明，与无佐剂狂犬病疫苗相比，干扰素佐剂狂犬病疫苗诱导产生中和抗体的时间早、滴度高，具有良好的免疫学效果。李茂光等研究显示PolyIC佐剂狂犬病疫苗可减少抗原用量，增强细胞免疫和体液免疫应答，特别是能产生早期的细胞免疫应答，从而提高传统狂犬病疫苗的保护效果。Zn(OH)2是含锌元素的一种无机纳米粒子，在一定条件下能以胶体的形式稳定存在，并具有吸附蛋白抗原的能力。有研究表明，Zn(OH)2作为佐剂与疫苗联合应用，其致敏原性和安全性优于氢氧化铝。利用水包油作为佐剂时，需要的抗原量较少，免疫剂量也少，可针对此原理进一步对狂犬病灭活疫苗进行开发创新。

（二）弱毒活疫苗 目前我国在犬的狂犬病免疫预防实际应用最广泛的仍然是弱毒活疫苗。我国使用的兽用狂犬病弱毒疫苗，从20世纪 50年代到80年代先后采用了羊脑固定毒减毒苗，Semple型疫苗和Flury-LEP疫苗。随后，弱毒疫苗所使用的毒株主要为SAD的衍生株，如SAG1和ERA等。ERA疫苗是基于在1935年于美国阿纳巴马的一头犬身上发现的狂犬病毒。这一毒株也是后来开发出来的SAD-B19疫苗的基础，这一疫苗是为野生动物口服用的，目的是减少自然界狂犬病毒的库存。SAD-B19毒力不弱，所以后来进一步减毒产生了SAG2，为印度改造的狂犬病病毒低毒疫苗，这也是现有的野生动物疫苗饵的主要成分之一。我国在80年代初从国外引进了ERA株，通过BHK21细胞进行生产，对犬的免疫力可达3年以上。中国药品生物制品检定所利用CTN181毒株在BHK21细胞传代细胞上生产疫苗，疫苗免疫原性同Flury-LEP相似，但安全性比Flury-LEP好。长春生物制品研究所研制的αG株原代仓鼠肾细胞佐剂疫苗，犬免疫接种后，中和抗体至少可保持1年，加强免疫1次，免疫期可持续2年以上。中国军事兽医研究所、长春生物制品研究所分别从SAD和CTN181株中筛选制备口服疫苗，犬口服后阳转率分别大于或等于97%和80%。

二、新型疫苗

（一）亚单位疫苗Fu等的研究表明，将杆状病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白经口服免疫接种，诱导浣熊产生了中和抗体，并能抵抗狂犬病强毒株的攻击。除此之外，也曾有学者利用酵母表达系统和真核表达系统来表达狂犬病病毒糖蛋白，酵母表达系统表达量很大，也可糖基化修饰，但糖基化位置和糖基化的类型会与天然蛋白存在差异，影响了免疫原性；用真核表达系统表达狂犬病病毒G蛋白和N蛋白，加佐剂对动物进行免疫可诱导机体对狂犬病病毒的细胞和体液免疫，并抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击，但哺乳动物细胞表达的亚单位疫苗工艺复杂、成本高、耗时长、表达水平低。因此该两种方法制备狂犬病病毒亚单位疫苗均受到一定的限制。

（二）DNA疫苗 Xiang Z Q等将编码狂犬病病毒糖蛋白的cDNA插到SV40启动子下游构建了狂犬病病毒的DNA疫苗，按设定计划免疫小鼠后，诱导小鼠体内产生了抗狂犬病病毒中和抗体、抗狂犬病病毒糖蛋白特异性CTL和分泌淋巴因子的Th细胞，用5倍LD50剂量的狂犬病病毒CVS株攻击小鼠，免疫鼠全部获得保护，对照组小鼠14天内全部死亡。还有国外学者将带有G基因的DNA包被在2.6μm金粒上免疫小鼠，初免及加免后均可在小鼠体内检测到高效价的抗体，持续300天。315天后用致死量的狂犬病病毒攻击，小鼠全部存活。在我国，扈荣良等首先将狂犬病病毒G基因插入PMTOIO/A+表达载体中，免疫小鼠后体内产生的抗狂犬病病毒抗体对狂犬病病毒强毒的攻击有一定保护作用。李萍等将狂犬病病毒G基因插入质粒PRC/CMV中，免疫小鼠可产生低滴度的中和抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。制备的狂犬病DNA疫苗由于外源目的基因进入细胞，特别是进入细胞核的数量少，免疫原表达量少，因此引发的免疫应答经常达不到预期水平。

（三）重组活载体疫苗

1.痘病毒载体疫苗 学者对以痘苗病毒为载体的重组活载体疫苗VRG研究的最透彻，使用也最多。痘病毒载体重组疫苗具有很多优点，比如生产简便、受原料限制较少、热稳定性好、可口服或皮上划痕免疫，显示出较大的应用潜力。欧洲及北美等地的野生动物以VRG进行口服免疫，已取得良好的免疫效果。但痘病毒载体狂犬病疫苗有一定的缺陷，主要表现在机体针对痘病毒产生的抗体会对相应载体疫苗的二次免疫产生一定的影响，降低其免疫效果，且不适合接种与人类密切接触的动物。为解决这个问题，开始有学者构建“非复制痘苗病毒载体”。此类载体在大多数哺乳动物细胞中降低或失去繁殖能力，却能有效表达外源基因，提高病毒疫苗载体的安全性。我国李萍等利用此原理构建了非复制型痘苗病毒载体狂犬病疫苗，免疫小鼠能使其快速产生滴度较高的中和抗体，抵抗致死剂量狂犬病病毒国际标准攻击毒株（CVS）和中国上海犬流行病毒街毒株（SBD）株的攻击。但外源基因的表达量随着病毒复制的减弱或消失也往往会降低，这也是限制其发展的一个重要原因。

2.腺病毒载体疫苗 Zhou D等构建了表达狂犬病病毒糖蛋白的黑猩猩腺病毒，可作为口服疫苗为机体提供黏膜免疫，阻止狂犬病病毒从黏膜感染机体。由于犬及犬鼬科野生动物是狂犬病病毒的主要宿主，且犬腺病毒的宿主范围广泛，毒株稳定，因此以犬腺病毒作为载体，构建狂犬病重组疫苗的意义更大。程玮等的研究中，获得了表达狂犬病病毒保护基因的重组犬2型腺病毒，在犬科动物取得了良好的免疫效果。

3.疱疹病毒载体疫苗 有学者将狂犬病G蛋白基因重组到犬疱疹病毒TK基因中构建出重组病毒并侵染MDCK细胞，可正确表达出G蛋白。将此重组犬疱疹病毒经鼻腔接种犬后，所产生的抗狂犬病病毒中和抗体的滴度要高于常规灭活狂犬病疫苗。

4.伪狂犬病毒重组狂犬病疫苗 伪狂犬病毒（PRV）是一种极具开发潜力的疫苗载体。PRV基因组为线性双链DNA，长度约143kb，遗传稳定性好；并含有许多病毒复制的非必需基因（TK、gI、gE、gG、PK），外源基因容量大，基因组具有感染性，转染细胞后即可开始复制，产生高滴度子代病毒。且PRV具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野生动物，但不感染人。吉林大学韩乃君利用Tn5转座子介导的方法，构建了一株同时表达SRV9糖蛋白和EGFP绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV/SRV9G/EGFP，利用该重组病毒对猫进行免疫，对重组病毒进行生物学特性和免疫学试验的研究。研究结果显示该重组病毒可以通过肌肉注射和口服免疫两种途径诱导受试猫机体产生针对狂犬病病毒具有保护水平的中和抗体，初步的安全性评价也未发现其对受试猫有毒害作用。从而提示转座方法可以作为一种简单、有效的技术应用于重组病毒疫苗的开发中，而得到的重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP有作为备选狂犬病口服疫苗的潜力。

三、小结

近年来我国宠物犬猫以及流浪犬猫的数量持续上升，狂犬病流行十分严重，国家及我省对狂犬病的免疫力度不断加大，对狂犬疫苗的需求也日益增加。狂犬病灭活疫苗具有安全、高效的优点，但是在应用上改进空间很大，不能墨守成规，要不断对灭活疫苗进行探索创新。狂犬病弱毒疫苗虽然存在一定的不安全因素，但是可以在野生动物中口服，也适用于流浪犬，值得探讨的是，如果安全，为什么目前不能用于人?基因疫苗与重组活载体疫苗仍处于试验探索阶段，尚未有在临床进行推广应用的产品。