双酶法水解辣椒粕蛋白的工艺研究

赵　静，王　燕*（湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128）

双酶法水解辣椒粕蛋白的工艺研究

赵静，王燕*
（湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128）

以水解度和肽得率为评价指标，研究了复合蛋白酶和风味酶双向酶解辣椒粕蛋白制备多肽的工艺条件，并在单因素试验的基础上采用正交试验对此工艺进行优化。结果表明，复合蛋白酶和风味酶双向酶解辣椒粕蛋白制备多肽的最佳工艺条件为：复合蛋白酶/风味酶质量比为2∶1，总酶用量为2%，酶解时间为6 h，酶解pH值为6.5，酶解温度为50℃。在此最佳条件下进行验证试验，测得酶解液的水解度为19.44%，肽得率为6.52%。

辣椒粕；蛋白酶；酶解

红辣椒经过提取得到辣椒红色素和辣椒素，其质量只占辣椒总质量的7%～10%，残余物辣椒粕占质量的90%～93%，辣椒粕中含有蛋白质、糖类、脂肪、维生素及多种矿物质元素，纤维素含量高达23.84%，蛋白质含量可达14%～19%［1］。目前，对辣椒蛋白的研究较少且主要集中在辣椒籽蛋白的研究。胡志辉等［2］对辣椒种子贮藏蛋白质的组成及含量进行了研究。宁娜［3］测定了9中辣椒籽的蛋白质组成，结果表明，氨基酸种类齐全，谷氨酸、天冬氨酸等鲜味氨基酸含量丰富。而在辣椒粕的研究方面，则主要针对饲料添加剂量进行研究，田宗祥等［4］在60～90 kg猪的饲料中添加2.5%去籽辣椒粕，可使屠宰率提高1.60%，同时添加辣椒粕组与未添加辣椒粕空白组对比，可明显改善猪肉品质，肉香味变浓，增强肌肉的多汁性，提高保水力。赵国群等［5］以辣椒粕水浸提液作为培养基，对4种酵母菌进行发酵培养，筛选出适宜以辣椒粕为原料生产细胞蛋白的优良菌种，为充分利用辣椒粕这一资源奠定基础。

近年来，全世界对蛋白资源作了较多深入的研究。水解植物蛋白是众所周知的调味产品。到目前为止，玉米蛋白［6］、花生蛋白［7］、菜籽蛋白［8］、米糠蛋白［9］、豆粕蛋白［10］、南瓜籽粕蛋白［11］等酶解产物中相继被发现含有独特生理活性的功能肽抑或是风味增强肽，其中大豆多肽、玉米多肽等成功进行了产业化。但在实际应用中就如何综合利用辣椒粕蛋白的研究和报道均较少。为了充分利用好这些蛋白质资源，对蛋白质进行水解是十分必要的。植物蛋白水解率一般较动物蛋白低，采用单酶水解较难获得足够短肽。复合蛋白酶与风味酶的适宜pH和温度范围较为接近，水解位点也具有一定互补性，因此生产和研究中两者多复配使用。

本研究以实验室自制的辣椒粕蛋白为底物，以水解度和肽得率为考察指标，研究了复合蛋白酶和风味酶双向酶解辣椒粕蛋白制备多肽的工艺条件，以期为辣椒粕蛋白的高值化利用提供新的理论依据，同时为实际生产中利用可控酶解技术水解植物蛋白制备鲜味肽奠定了工艺基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

辣椒粕：山东中椒英潮辣业发展有限公司；辣椒粕蛋白为实验室自制（蛋白质含量约为59.14%）：复合蛋白酶（120 U/mg）、风味酶（200 U/mg）：上海楷洋生物技术有限公司；氢氧化钠、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、盐酸、硼砂、甲醛、无水硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、硼酸等化学试剂均为分析纯：天津市风船化学试剂科技有限公司；D45 mm透析袋（截留分子质量8 000～14 000 u）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2仪器与设备

FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AUY220型分析天平：日本岛津公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱、DK-S28型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；pHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；KDN-103F型定氮仪：上海纤检仪器有限公司；台式低速离心机TDZ5型离心机：湖南赫西装备仪器有限公司；GL-3250B磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；FD-1B冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1辣椒粕蛋白制备多肽的工艺流程

辣椒粕→粉碎→过100目筛→超声辅助碱溶酸沉法提取（料液比1∶20（g∶mL），温度50℃，时间4 h，超声功率250 W）→离心分离（3 000 r/min离心15 min）→收集上清液→酸沉（稀盐酸调节pH至3.6）→离心分离（3 000 r/min离心15 min）→收集沉淀→经透析袋脱盐（截留分子质量8000～14000u）→冷冻干燥（温度-50℃，时间10 h）→辣椒粕蛋白→酶解（复合蛋白酶和风味酶水解辣椒粕蛋白）→灭酶（沸水浴中保持5 min）→自然冷却→离心分离（3 000 r/min离心15 min）→取上清液→辣椒粕蛋白多肽液

1.3.2复配酶双向酶解的单因素试验

复合蛋白酶和风味酶比例：总酶用量2%（相对于辣椒粕蛋白的质量），酶解pH 6.5，酶解时间5 h，酶解温度50℃时，考察复合蛋白酶和风味酶的质量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（g∶g））对辣椒粕蛋白酶解效果的影响。

总酶用量：复合蛋白酶和风味酶的质量比2∶1，酶解pH值6.5，酶解时间5h，酶解温度50℃时，考察总酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）对辣椒粕蛋白酶解效果的影响。

酶解时间：复合蛋白酶和风味酶的质量比2∶1，总酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解温度50℃时，考察酶解时间（4h、5h、6 h、7 h、8 h）对辣椒粕蛋白酶解效果的影响。

酶解pH值：复合蛋白酶和风味酶的质量比2∶1，总酶用量2%，酶解时间5 h，酶解温度50℃时，考察酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）对辣椒粕蛋白酶解效果的影响。

酶解温度：复合蛋白酶和风味酶的质量比2∶1，总酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解时间5 h时，考察酶解温度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）对辣椒粕蛋白酶解效果的影响。

1.3.3复配酶双向酶解的正交试验

在单因素试验结果的基础上，将固液比固定为1∶10（g∶mL），固定总酶用量2%，以水解度和肽得率为评价指标，作复合蛋白酶和风味酶的质量比、酶解时间、酶解pH值、酶解温度的4因素3水平L9（34）的正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。

表1　辣椒粕蛋白酶解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

1.3.4辣椒粕蛋白酶解液的水解度及肽得率的测定

水解度是衡量蛋白质水解的重要指标之一，水解度越大，表明蛋白质水解越彻底，游离氨基酸的含量越高［12］。在蛋白酶解过程中，由于酶作用程度的不同导致蛋白质的降解程度不同，从而使得蛋白水解物中氨基酸和肽的含量存在一定的差异。当蛋白酶解产物中氮的存在形态主要是以肽基氮形式存在时，肽得率将提高，酶解液会呈现良好的风味和口感。按照凯氏定氮法测定总氮（total nitrogen，TN）甲醛电位滴定法［13］测定酶解液中游离氨基酸态氮（amino nitrogen，AN）。水解度及肽得率［14］的计算公式如下：

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1复合蛋白酶和风味酶的质量比对辣椒粕蛋白酶解的影响

图1　复合蛋白酶/风味酶对辣椒粕分离蛋白酶解的影响Fig.1 Effect of mass ratio of protamex to flavorzyme on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由图1可知，随着复合蛋白酶所占比例的增加，水解度呈先上升后下降趋势，肽得率也缓慢升高，当复合蛋白酶和风味酶的质量比为2∶1时，水解度为20.04%，肽得率为6.42%，且均达到最大值。这是因为复合蛋白酶属于非特异性蛋白质肽键内切酶，辣椒粕蛋白在其作用下快速水解，生成游离氨基酸和小分子肽。同时，辣椒粕蛋白经酶解后其疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的酶解液将会带有明显苦味；而风味酶是经深层发酵生产的蛋白酶和肽酶的复合物，含有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性，可以有效地将疏水性氨基酸从脯氨酸末端切除，有助于酶解形成良好风味［15］。因此，综合这两种酶的作用效果及酶的价格，选择复合蛋白酶和风味酶的质量比为2∶1。

2.1.2总酶用量对辣椒粕蛋白酶解的影响

图2　总酶用量对辣椒粕分离蛋白酶解的影响Fig.2 Effect of total enzyme addition on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由图2可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率随着酶用量的增多先升高后降低。这是由于添加一定量的蛋白酶，其活性位点与底物充分接触，酶解效果较好，继续加酶，肽在继续酶解的过程中将会降解为游离氨基酸，肽得率降低。所以，综合酶解效果和酶的价格，选择总酶用量为2%。

2.1.3酶解时间对辣椒粕蛋白酶解的影响

图3　酶解时间对辣椒粕分离蛋白酶解的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度和肽得率均呈现先上升后下降的趋势。在水解初期，水解程度快速增加；在酶解时间5 h时，水解度为20.02%，而肽得率达到最大值6.43%；在酶解时间6h时，水解度达到最大值20.50%，肽得率相对较高即为6.39%，之后便显著降低。这可能是由于在一定时间内，蛋白质得到充分的酶解，且都以小肽形式存在，故肽得率较高；继续延长酶解时间，酶解液体系内的产物增加到一定浓度，反而对酶的活力产生抑制作用，使肽得率下降［16］。因此确定复配酶双向酶解时间为5 h。

2.1.4酶解pH值对辣椒粕分离蛋白酶解的影响

图4　酶解pH值对辣椒粕分离蛋白酶解的影响Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the hydrolysis of hot pepper residues protein

从图4可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率随酶解pH值的增大先升高，后降低。当pH值为6.0时，水解度达到最大值21.66%，肽得率较低；当pH值为6.5时，水解度相对较高，肽得率达到最大值6.47%。究其原因，可能是由于中性的复合蛋白酶和风味酶以2∶1复配时，在中性至微酸性条件对辣椒粕蛋白有较好的水解效果。故确定酶解pH值为6.5。

2.1.5酶解温度对辣椒粕分离蛋白酶解的影响

图5　酶解温度对辣椒粕分离蛋白酶解的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由图5可知，当酶解温度在40～50℃时，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率显著升高；随着酶解温度的继续升高，水解度和肽得率急剧降低。这是因为随着温度的升高，酶与底物之间的接触机会增多，水解度增大，肽得率升高；继续升高温度，蛋白酶丧失活性，酶解效果下降［16-17］。因此，选择复配酶双向酶解温度为50℃。

2.2辣椒粕蛋白酶解条件优化的正交试验结果

在单因素试验基础上，固定总酶用量为2%，以水解度和肽得率为评价指标，考察复合蛋白酶和风味酶的质量比、酶解时间、酶解pH值、酶解温度对结果的影响。辣椒粕蛋白酶解正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，以水解度为评价指标，影响水解度的因素主次关系是C＞B＞A＞D，即酶解pH值＞酶解时间＞酶的复配比＞酶解温度。水解度最高的酶解最佳工艺组合为A3B3C1D2；而以肽得率为评价指标，影响肽得率的因素主次关系是A＞C＞B＞D，即酶的复配比＞酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度。肽得率最高的酶解工艺组合为A2B3C2D2。

由表3可知，因素A、B、C对水解度影响达到极显著水平（P＜0.01），因素D对水解度影响达到显著水平（0.01＜P＜0.05）；因素A、C对肽得率影响达到极显著水平（P＜0.01），因素B、D在实验水平范围内对肽得率几乎没有显著影响。

表2　辣椒粕蛋白酶解条件优化正交试验结果与分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3最优组合验证试验

由于理论最优水平组合A3B3C1D2或A2B3C2D2均未出现在试验方案中，故应进行验证试验，即组合A3B3C1D2酶解条件为：复合蛋白酶和风味酶的质量比为3∶1，总酶用量为2%，酶解时间为6 h，酶解pH值为6.0，酶解温度为50℃进行酶解试验，测得酶解液的水解度为19.31%，肽得率为6.41%。组合A2B3C2D2酶解条件为：复合蛋白酶和风味酶的质量比为2∶1，总酶用量为2%，酶解时间为6 h，酶解pH值为6.5，酶解温度为50℃进行酶解试验，测得酶解液的水解度为19.44%，肽得率为6.52%。经验证试验比较得出，最优的水平组合为A2B3C2D2。

3　结论

通过单因素和正交试验确定了复合蛋白酶和风味酶双向酶解辣椒粕蛋白的最佳工艺条件为复合蛋白酶和风味酶的质量比为2∶1（g∶g），总酶用量为2%，酶解时间为6 h，酶解pH值为6.5，酶解温度为50℃。在此条件下得到的辣椒粕蛋白酶解液的水解度为19.44%，肽得率为6.52%。因此，酶解是一条优化辣椒粕蛋白的途径，研究结果为酶解辣椒粕蛋白制备呈味肽或抗氧化肽等提供了理论依据，今后还将对不同酶制剂组合复配水解植物蛋白（hydrolyzed vegetable protein，HVP）生产增味香精提供参考，以期达到低值植物蛋白的高值化利用，对蛋白质的精深加工具有重要的指导意义。

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Technology of hot pepper residues protein hydrolysis by double enzymes

ZHAO Jing，WANG Yan*
（College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

With hydrolysis degree and peptide yield as evaluation index，the hot pepper residues protein was hydrolyzed by double enzymes（protamex and flavorzyme）method and its hydrolysis technology was researched.On the base of single factor experiments，the hydrolysis technology was optimized by orthogonal experiment.The results showed that the optimum hydrolysis technology conditions were as follows：protamex and flavorzyme mass ratio 2∶1，total enzyme addition 2%，hydrolysis time 6 h，pH 6.5，hydrolysis temperature 50℃.Under this condition，the hydrolysis degree was 19.44%，the peptide yield was 6.52%.

hot pepper residues；protease；enzymatic hydrolysis

X705

A

0254-5071（2015）11-0066-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.015

2015-10-10

湖南省教育厅重点项目（编号：13A040）

赵静（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养。

王燕（1968-），女，教授，博士，研究方向为食品化学与营养。