瘦肉精（盐酸多巴胺）对秀丽隐杆线虫的毒理作用

刘海翠薛 婷武中平张宇思高 巍

瘦肉精（盐酸多巴胺）对秀丽隐杆线虫的毒理作用

刘海翠1薛 婷3武中平2张宇思1高 巍2

目的 研究分析盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2及突变体的毒理作用。方法 以不同浓度的盐酸多巴胺暴露野生型秀丽线虫N2 的L1幼虫至年轻成虫（young adult），以K缓冲液作为空白对照，通过检测暴露后秀丽线虫的存活率，运动行为，以及对热激，过氧化等氧化应激反应，记录暴露后线虫存活率，身体弯曲，头部摆动，发育等生理指标，分析盐酸多巴胺的毒性对线虫的毒性作用。结果 与空白对照组比较，盐酸多巴胺浓度0.1 mg/ml以上有明显致死作用，从浓度0.1 mg/ml开始对秀丽线虫产生毒害作用，表现为身体弯曲、头部摆动频率降低，体长减少，氧化应激反应表现为对热激和过氧化反应更敏感。结论 盐酸多巴胺对秀丽线虫的神经系统，生殖及发育都有毒害作用。

盐酸多巴胺；秀丽隐杆线虫；毒性分析

【Abstract】

Objective Our study was to investigate the toxicity of Dopamine Hydrochloride using Caenorhabditis elegans. Methods The C.elegans were treated with different dose of Dopamine Hydrochloride， and the control group were treated with k-medium. The toxicity was detected using the indicators of suivial， body bends， head thrashes，brood size and development. Results Compared with the control group， exposure to Dopamine Hydrochloride at the concentration 0.1 mg/ml，the survival of nematode was decreased significantly， and the indicators of body bends， head thrashes ，body length and brood size were also significantly decreased，Oxidative stress reaction is more sensitive to heat stress and peroxidation .Conclusion Dopamine Hydrochloride is toxic to the nervous system ， the reproduction system and the development of C.elegans.

【Key words】Dopamine Hydrochloride，Caenorhabditis elegans，Toxicity

盐酸多巴胺是一种β-肾上腺素激动剂（简称β-兴奋剂），是多巴胺受体激动药，俗称”瘦肉精”的一种。它能使猪提高生长速度，增加瘦肉率，肥猪饲喂瘦肉精后，逐渐发生四肢震颤无力，心肌肥大心力衰竭等毒副作用。食用后直接危害人体健康，会使患者出现肌肉振颤、心慌、战栗、头疼、恶心、呕吐等症状。含“瘦肉精”的食品对心脏病、高血压患者、老年人的危害更大，严重的可导致死亡［1］。因此，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物禁止使用β激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）［2-5］。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），属于线形动物门、线虫纲，虫体非常小，成虫只有1 mm左右。秀丽隐杆线虫作为模式生物的典型代表，它生命周期短、体积小、易于在实验室进行培养，培养成本低。线虫基因组与人类基因组有约40%的同源，这就表示在秀丽线虫中进行的毒理学研究能在很大程度上反映相关毒物也可能对人体构成危害。目前，秀丽隐杆线虫已作为一种模式生物在医学、药学、遗传学和环境科学等领域有了广泛应用［6］。在毒理学研究领域，秀丽线虫已经被应用在重金属、纳米材料、环境毒理评价等的毒性研究方面［7-9］。本文利用秀丽线虫分析研究盐酸多巴胺的毒理性质，为瘦肉精的检测提供了新的思路和方法，也能进一步明确瘦肉精对人体造成的危害。

1　材料与方法

1.1生物材料准备

野生型秀丽隐杆线虫N2，购自秀丽线虫遗传中心（Caenorhabditis genetic center，CGC），培养线虫采用标准程序［10］。大肠杆菌OP50菌株本公司实验室保存，作为线虫的食物。把冻存的OP50菌液在LB平板上划线，37℃培养过夜。分别挑取单菌落于LB培养基中，180 rpm震荡培养10～16 h，待LB液体培养基变浑浊即可。把准备好的菌液涂布在NGM平板上，即可喂食线虫。

1.2主要试剂及配制

盐酸多巴胺（Dopamine Hydrochloride）购自LGC（盐酸多巴胺盐标准品，货号CDCT-C13082000，白色粉末，纯度99.9%）。盐酸多巴胺用水溶解后备用。LB液体培养基：tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 5 g/L；K-meduim：0.596 4 g KCl、0.745 1 g NaCl加蒸馏水定容到250 ml； NGM平板，用975 ml 蒸馏水溶解3 g NaCl，17 g agar，2.5 g polyptone，高压灭菌，待温度达到50℃～60℃左右加入1 ml 1 mol/L CaCl2， 1 ml 1 mol/L MgSO4，1 ml 5 mg/L胆固醇，25 ml磷酸钾缓冲液，混匀后倒入培养皿，制成NGM平板。

1.3暴露方法

将秀丽线虫同步化，待生长至L1时期，从NGM平板上洗下来，转移到加入食物的K-meduim内，均分到24孔板中，每孔大约放50条线虫，在每孔中加入不同浓度的盐酸多巴胺溶液使其使其终浓度分别为0.1 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml，空白对照加入等体积K-meduim，放置在20℃培养箱中，培养48 h直至秀丽线虫成长为年轻成虫，然后记录各个生理指标的变化［11］。

1.4存活率

用盐酸多巴胺处理后，在解剖镜下观察线虫，并用消毒金属针刺激线虫以确定其是否的死亡或麻痹（死亡秀丽线虫无任何回应）记录死亡数目。存活率是活着的秀丽线虫在测试板上所有秀丽线虫中所占比例。每一个处理进行5次实验，各50条线虫。

1.5运动行为

运动行为通过头部摆动频率、身体弯曲频率2个方面进行评价。每次测试15只线虫。

（1）头部摆动测试 将完成暴露的秀丽线虫转移到含有200 μL的K-meduim的NGM平板（无食物）上，待其恢复1 min后，测试线虫在后1 min内头部摆动次数，每当线虫身体摆动到只有体长一半时定义为一次头部摆动。

（2）身体弯曲测试 将完成暴露的秀丽线虫转移到新的NGM平板（无食物）上，待其恢复1 min后，记录其在20 s内身体弯曲的次数，以线虫身体形成的S型中轴线为轴，向前行进一个正弦波形的过程定义为一次成功的身体弯曲。

1.6生殖

线虫的生殖力以其后代数量来评价。将L1期线虫用不同浓度盐酸多巴胺暴露48 h后，将线虫用无菌水清洗干净，每个平板放1条线虫，每剂量组10个平板，（产卵时要一天换一次平板，若暴露期间产卵，换平板时注意换上含样品的平板，直至暴露时间结束），计算所有平板中线虫的总数。每个处理重复5次［12］。

1.7发育

发育通过秀丽线虫体长来进行评价。将L1期线虫幼虫用不同浓度盐酸多巴胺暴露48 h后，将线虫清洗后制片，利用显微镜照相后，运用photoshop统计其身体从头部到尾部中轴线长度。每个处理进行5次重复实验。

1.8抗热激反应

将经过盐酸多巴胺暴露后的线虫置于35℃培养箱中，每隔2 h，在解剖镜下观察并记录不活动的线虫的数目，并用消毒金属针刺激以确定其中的死亡和麻痹的秀丽线虫数目（死亡秀丽线虫无任何回应）。每一个处理重复5次，每次分析30条线虫。

1.9抗氧化测定

将L1期线虫幼虫用不同浓度盐酸多巴胺暴露48 h后，将线虫清洗后分别置于含40 mM百草枯的K meduim中，每天在解剖镜下观察并记录不活动的线虫的数目，并用挑针刺激以确定其中的死亡和麻痹的秀丽线虫数目（死亡秀丽线虫无任何回应）。每一个处理重复5次，每次分析30条线虫。

2　结果

2.1盐酸多巴胺对线虫的存活率的影响

图1　盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2存活率的影响

经过实验，用不同浓度盐酸多巴胺暴露秀丽线虫48 h，在0.1 mg/ml的剂量下能使线虫的存活率显著（P＜0.05）下降，在1 mg/ml的剂量下能使其存活率降低极显著（P＜0.01），这说明盐酸多巴胺毒性较大，一定剂量下可以直接对线虫产生致死效应。

2.2盐酸多巴胺对秀丽线虫N2运动行为的影响

图2　盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2运动行为的影响

盐酸多巴胺对秀丽线虫的运动行为有明显的影响，在0.1 mg/ml的剂量以上能极显著（图2，P＜0.01）降低野生型秀丽线虫的头部摆动和身体弯曲频率，说明盐酸多巴胺对线虫的神经系统毒害影响较大。

2.3盐酸多巴胺对秀丽线虫N2生殖的影响

图3　盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2生殖的影响

盐酸多巴胺在0.1 mg/ml的剂量以上能（图3，P＜0.05）降低秀丽线虫的后代数量，在0.5 mg/ml以上的浓度下对秀丽线虫的后代数量的影响极（P＜0.01），因此可以证明盐酸多巴胺对秀丽线虫生殖力毒害较为严重。

2.4盐酸多巴胺对线虫发育的影响

图4　盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2发育的影响

盐酸多巴胺在0.5 mg/ml的剂量以对线虫的体长能极的降低（图4，P＜0.01），因此可以证明盐酸多巴胺对秀丽线虫生发育毒害较为严重。

2.5盐酸多巴胺暴露后线虫对热激的反应

图5　盐酸多巴胺暴露对秀丽线虫热激的影响

盐酸多巴胺暴露后，线虫对于热激的反应更为敏感，而且呈剂量相关的关系，剂量越大，线虫死亡越快（图4左），秀丽线虫的平均寿命在0.1 mg/ml的剂量以上能显著降低（图4右，P＜0.05），1 mg/ml的剂量以上其平均寿命降低极能显著（图4右，P＜0.01），由此可以证明盐酸多巴胺暴露能使线虫对热激的反应更敏感，更大幅度加快了线虫的死亡。

2.6盐酸多巴胺暴露后线虫的氧化应激反应

盐酸多巴胺暴露后，线虫对于百草枯的氧化反应更为敏感，而且呈剂量相关的关系，剂量越大，线虫死亡越快（图6左），秀丽线虫的平均寿命在0.1 mg/ml的剂量以上能降低（图6右，P＜0.05），0.1 mg/ml的剂量以上其平均寿命降低极能（图6右，P＜0.01），由此可以证明盐酸多巴胺暴露能使线虫对氧化应激的反应更敏感，更大幅度加快了线虫的死亡。

图6　盐酸多巴胺对野生型秀丽线虫N2氧化应激反应

3　讨论

秀丽线虫是作为重要模式生物之一，已经被成功的应用在重金属，环境污染物，植物成分的毒理研究等方面。它饲养条件简单、实验成本低、易操作，整个生命周期只有1个月左右，大大缩短了实验的周期，还可以像培养细菌一样保存在-80℃环境中。同时，秀丽隐杆线虫还具备遗传背景清楚、对多系统毒性敏感、行为反应模式稳定、测试周期短及结果灵敏可靠等特点［13-14］。

如盐酸克伦特罗，莱克多巴胺等瘦肉精已被证实对人体有很大危害［15］，已被各国严令禁止在畜类产品中使用。盐酸多巴胺作为瘦肉精的重要种类，其毒性也应得到大家更多重视。本文使用秀丽线虫进行瘦肉精（盐酸多巴胺）的毒理分析大大降低了实验成本，而且不需要使用昂贵的大型仪器，操作简便，利进行，相对于果蝇和小鼠等其他模式生物，秀丽线虫对于瘦肉精检测的敏感度也得到了提高。

本研究结果显示，盐酸多巴胺在一定剂量下，可以对秀丽线虫的生命，运动行为，生殖，发育等系统造成危害。线虫暴露在0.1 mg/ml的剂量下就可以对线虫的存活，运动系统和生殖系统产生显著地改变，且各个剂量均有统计学意义，线虫暴露在0.5 mg/ ml的剂量以上可对线虫的发育系统产生极显著的影响，且个剂量都有统计学意义。另外本研究还对盐酸多巴胺对线虫的抗热激和氧化应激反应做了研究，结果表明一定浓度的盐酸多巴胺可以使线虫对这些逆境的反应更敏感。

［1］ 薇晓.为食品安全拉起一道警戒线食品中的污染物及限量标准解读［J］.中国卫生标准管理，2013，4（11）：26-28.

［2］ Aymeric Douillard .Time course in calpain activity and autolysis in slow and fast skeletal muscle during clenbuterol treatment，Can. J. Physiol. Pharmacol［J］.2011，89（2）：117-125.

［3］ Chan TY. Health hazards due to clenbuterol residuesin food［J］.J Toxicol Clin Toxicol，199，37（4）：517-519.

［4］ Leung， M.C.K.， Williams， P.L.， Benedetto， A.，et al. Caenorhabditis elegans： an emerging model in biomedical and environmental toxicology［J］.Toxicol. Sci.2008，106（1），5-28.

［5］ Dhawan R， Dusenbery DB， Williams PL.Comparison of lethality， reproduction， and behavior as toxicological endpoints in the nematode Caenorhabditis elegans［J］.J Toxicol Environ Health A.1999，58（7）：451-462.

［6］ PANG Lin-hai，DU Ai-fang，LI Xiao-jun，et al.Culture characters and preservation method of Caenorhabditis elegans［J］. Acta Agriculturae Zhejiangensis，2007，19（1）：34-36.

［7］ 汪洋，王大勇.铜中毒引起的秀丽线虫世代间可传递的缺陷［J］.安全与环境学报，2007，7（2）：10-14.

［8］ Jiang B， Ren C， Li Y， et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans［J］.J Biol Inorg Chem，2011，16（2）：267-274.

［9］ Warheit D B'Webb T R，Sayes C M，et a1.Pulmonary instillation studies with nanoscale Ti02 rods and dots in rats：Toxicity is not dependent upon size and surface area［J］.Toxicological Sciences，2006，91（1）：227-236.

［10］ Grishok A. RNAi mechanisms in Caenorhdbditis elgans［J］.FBES Letters，2005，579（26）：5932-5939.

［11］ 刘海翠，武中平，张宇思，等.瘦肉精（硫酸沙丁胺醇）对秀丽隐杆线虫的毒性分析［J］.中国卫生标准管理，2015，6（13）：12-14.

［12］ 孔璐，张婷，王大勇，等.纳米二氧化硅对秀丽隐杆线虫的毒性作用研究［J］.生态毒理学报，2011，6（6）：655-660.

［13］ Ju J-J，Ruan Q-L，Li X-B，et al. Neurotoxicological evaluation of microcystin-LR exposure at environmental relevant concentrations on nematode Caenorhabditis elegans［J］.Environ Sci Pollut Res 20：1823-1830.

［14］ Boyd WA， Smith MV， Kissling GE， et al. Application of mathematical model to describe the effects of chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans development［J］. Environmental Science and Pollution Research，2013，3（20）：1823-1830.

［15］ Ziheng Zhuang，Yunli Zhao，Qiuli Wu，et al.Adverse Effects from Clenbuterol and Ractopamine on Nematode Caenorhabditis elegans and the Underlying Mechanism［J］.PLOS ONE，2014，1（9）e85482.

Toxicity of Dopamine Hydrochloride to Caenorhabditis Elegans

LIU Haicui1XUE Ting3WU Zhongping3ZHANG Yusi1GAO Wei21 Boilogical Medicine Research Center，Xiuli Biological Technology Ltd.，Changzhou 213000，China，2Jiangsu Product Quality Supervision and Inspection Institute，Nanjing 210007，China， 3 School of Pharmaceutical Engineering and Life Sciences， Changzhou University， Changzhou 213164， China

R155.5

A

1674-9316（2015）33-0004-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2015.33.003

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高巍 E-mail：jszjgaowei@yahoo.com.cn

江苏省质量技术监督局科研项目（KJ145708）

基金项目：常州科技支撑计划（社会发展）（CE20135031）