补益营卫方、TGFβ1及bFGF对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达的影响

周小平，司晓伟，徐武清，俞　洋

（宁夏医科大学中医学院宁夏银川750004）

·基础研究·

补益营卫方、TGFβ1及bFGF对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达的影响

周小平，司晓伟，徐武清，俞洋

（宁夏医科大学中医学院宁夏银川750004）

目的：研究补益营卫方、转化生长因子β1（TGFβ1）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达的影响。方法：通过连续传代培养复制衰老人皮肤成纤维细胞模型，通过中和抗体阻断TGFβ1及bFGF后，利用荧光定量PCR法检测衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达。结果：人皮肤成纤维细胞衰老时，c-Jun基因表达水平24h和48h比人年轻皮肤成纤维细胞分别下降了70%和71%，72h则两者的表达水平相当。衰老人皮肤成纤维细胞补益营卫药物处理后显著提高了c-Jun基因的表达，相对于衰老人皮肤成纤维细胞，其24h、48h分别提高了4.67倍和2.12倍，而至72h其表达水平相当。中和TGF-β1蛋白后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达水平24h和72h分别是年轻人皮肤成纤维细胞的2.4倍和1.7倍。而48h时，年轻人皮肤成纤维细胞的基因表达水平是衰老人皮肤成纤维细胞的9.2倍。衰老人皮肤成纤维细胞补益营卫药物处理后显著提高了c-Jun基因的表达，48h和72h时c-Jun基因的表达水平分别是衰老人皮肤成纤维细胞的2.3倍和1.5倍。中和TGF-β1和bFGF蛋白后，c-Jun基因的表达水平随着时间的不同被明显下调；与年轻人皮肤成纤维细胞相比，24h、48h和72h衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达水平分别下降了64.5%、94.2%和73.7%。衰老人皮肤成纤维细胞补益营卫药物处理后c-Jun基因的表达随着时间的不同相对于衰老人皮肤成纤维细胞被显著上调。24h、48h和72h分别是衰老人皮肤成纤维细胞的9.7倍、3.6倍和9.8倍。纵向比较来看，TGF-β1蛋白对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达存在复杂的调节作用。bFGF蛋白对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达有明显的促进作用。结论：衰老时人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达紊乱。补益营卫方对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达具有促进作用；其促进c-Jun基因表达存在不依赖于TGF-β1和bFGF的途径。bFGF蛋白是TGF-β1信号调节途径的下游蛋白；是c-Jun基因表达的重要促进因子。

补益营卫；TGFβ1；bFGF；c-Jun；皮肤衰老

皮肤衰老研究一直是衰老研究的热点领域之一。皮肤衰老是内在时序衰老的结局之一，治疗内在时序衰老是治本之策。中医理论认为营卫具有“温分肉、充皮肤、肥腠理、司开合”的作用，因此，营卫与皮肤的生理与病理密切相关；营卫的盛衰与皮肤衰老直接相关。营卫与元气一样随着年龄的增长逐渐衰弱，适时补益营卫有助于延缓皮肤衰老。笔者前期研究显示补益营卫方具有增加衰老皮肤胶原、改善衰老皮肤形态学的作用［1］。这些作用与TGFβ1［2］和bFGF［3］等因子及补益营卫方促进衰老皮肤成纤维细胞增殖有关［4］。c-Jun是细胞早期反应基因产物，与c-Foc通常形成AP-1而发挥作用，被认为是介导生长刺激信号的核信使。该基因的表达增加及其反式激活作用在细胞增殖及表型分化中起着重要作用。本研究将探讨补益营卫方、TGFβ1和bFGF对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的影响。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株：人皮肤成纤维细胞株购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库（编号：KCB 200505S）。

1.1.2实验药物：实验所用中药材人参、生黄芪和甘草购自宁夏医科大学中医门诊，为宁夏明德中药饮片有限公司生产优质饮片。用水煎两次，煎液5 000rpm离心20min取上清，用蒸馏水定容至1g/ml（每毫升含生药材1g）浓度冷藏备用。用时高压灭菌，用培养基稀释为2.5%浓度用于细胞培养。

1.1.3实验仪器及试剂：见表1。

1.2方法

1.2.1细胞传代培养：人皮肤成纤维细胞株（3～5代）传代培养至衰老［5］（40代左右）制造衰老成纤维细胞模型。培养方法为：细胞用DMEM完全培养基（含100U/ml链霉素、100U/ml青霉素、10%胎牛血清）于37℃，5%CO2培养箱中常规培养。当细胞融合生长至75%～85%时，进行再传代，上述操作均于超净工作台中完成。其中取8～10代细胞为年轻对照；衰老细胞分为两组，一组常规培养基培养，一组用含2.5%药物的培养基培养。

表1　实验仪器、试剂及其生产厂家

1.2.2对衰老人皮肤成纤维细胞的干预：衰老细胞的处理分三种情况。第一种情况，衰老细胞分为两组，一组常规培养基培养，一组用含2.5%药物的培养基培养。第二种情况，衰老细胞分为两组，一组衰老细胞培养基中加入TGFβ1中和抗体（浓度为1.0μg/ml）培养；另一组用含2.5%药物的培养基中再加入TGFβ1中和抗体培养。第三情况，衰老细胞分为两组，一组衰老细胞培养基中加入TGFβ1和bFGF中和抗体（浓度为1.0μg/ml）培养；另一组用含2.5%药物的培养基中再加入TGFβ1与bFGF中和抗体培养。并分别于24h、48h和72h分别收集细胞，抽提总RNA，用实时荧光定量PCR法定量c-Jun基因表达。每个指标测三个样本，取平均值。

1.2.3实时荧光定量RT-PCR

1.2.3.1引物设计：从GenBank下载TGFβ1（NM_ 000660.4）、bFGF（NM_002006.4）、c-Jun（NM_ 002228.3）mRNA序列，设计如下引物：TGFβ1上游引物5′GAGAAGAACTGCTGCGTGCGG3′；下游引物5′GCGTGTCCAGGCTCCAAATGT3′。bFGF上游引物5′TTTTCAGTCTTCGCCAGGTCA3′；下游引物5′TTCGGCAACAGCACACAAATC3′。c-Jun上游引物5′

AGCGGCGGAAAGCAGCGGT3′；下游引物5′ACCGCCGTGGAGAAGCCTAA 3′。以β-actin为内参基因（详细信息参见CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0900）。

1.2.3.2提取样本总RNA：用超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd（Cat#CW0581））按产品说明书提取细胞样本中总RNA。

1.2.3.3逆转录：用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd（Cat#CW0744））按产品说明书进行逆转录。

1.2.3.4电泳：取5μlRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测目的条带，回收纯化用于后续实验。

1.2.3.5荧光定量PCR分析：用Roche480型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。计算公式为：

建立筛选引物标准曲线及融解曲线：取样本cDNA进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60～95℃进行融解曲线分析，并绘制目的基因和内参基因的标准曲线和融解曲线（由仪器自动完成）。各标准曲线的R2均达到0.99，说明线性相关度很高；扩增效率均在90%以上，熔解曲线峰呈单峰，特异性强，因此可采用此种方法和上述引物进行后续样本的扩增分析。

样品RealTimePCR分析：将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，重复孔道数为3。同时在60-95℃进行溶解曲线分析（由仪器自动完成）。

PCR反应体系：用UltraSYBR Mixture（with Rox）（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0956）进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°10min，（95℃15s，60℃60s）×40个循环。RealTime反应体系为：Ultra SYBR Mixture（2×）10μl、上游引物（10μM）0.4μl、下游引物（10uM）0.4μl、模板2μl，加入灭菌蒸馏水至20μl。

2　结果

2.1人皮肤成纤维细胞衰老时c-Jun基因的表达

如图1。人皮肤成纤维细胞衰老时c-Jun基因表达24h和48h其表达水平比年轻人皮肤成纤维细胞分别下降了70%和71%，72h则两者的表达水平相当，提示衰老时人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达紊乱。衰老人皮肤成纤维细胞补益营卫药物处理后显著提高了c-Jun基因的表达，相对于衰老人皮肤成纤维细胞，其24h、48h分别提高了4.67倍和2.12倍。而至72h其表达水平相当，提示补益营卫方改善了细胞衰老时的c-Jun基因表达紊乱。

图1　各组c-Jun基因的表达

图3　阻断TGF-β1和bFGF各组c-Jun基因的表达

2.2中和TGF-β1蛋白后衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达

如图2。中和TGF-β1蛋白后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达24h和72h时，分别是年轻人皮肤成纤维细胞的2.4倍和1.7倍。而48h时，年轻人皮肤成纤维细胞的基因表达水平是衰老人皮肤成纤维细胞的9.2倍，提示TGF-β1蛋白对c-Jun基因表达具有一种复杂作用。衰老人皮肤成纤维细胞经补益营卫药物处理后显著提高了c-Jun基因的表达，48h和72h时c-Jun基因的表达水平分别是衰老人皮肤成纤维细胞的2.3倍和1.5倍。从曲线图来看，药物干预具有刺激衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达的作用。

2.3中和TGF-β1和bFGF蛋白后衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达

如图3。中和TGF-β1和bFGF蛋白后，c-Jun基因的表达水平随着时间的不同被明显下调；与年轻人皮肤成纤维细胞相比，24h、48h和72h衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达水平分别下降了64.5%、94.2%和73.7%。衰老人皮肤成纤维细胞经补益营卫药物处理后c-Jun基因的表达随着时间的不同相对于衰老人皮肤成纤维细胞被显著上调。24h、48h和72h分别是衰老人皮肤成纤维细胞的9.7倍、3.6倍和9.8倍。提示补益营卫方促进c-Jun基因表达。

图2　中和TGF-β1后各组c-Jun基因的表达

3　讨论

营卫有“充皮肤、肥腠理”的作用，这一作用与皮肤营养直接相关。营卫的盛衰直接关系着皮肤的质地与外观，年轻还是衰老。故《伤寒论·平脉法》曾指出：“卫气衰，面色黄，荣气不足，面色青。荣为根，卫为叶，荣卫俱微，则根叶枯槁……。”因此，充实营卫可以维持皮肤的健康靓丽，延缓皮肤衰老的发展。

成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其功能的正常与否与皮肤的健康与否密切相关。衰老时皮肤成纤维细胞增殖能力下降，其分泌的在保持皮肤美白、饱满及皮肤弹性方面具有重要作用的细胞外基质蛋白胶原蛋白的含量逐渐降低［6］，缺少弹性、易碎［7］。成纤维细胞的这些变化导致皮肤变薄，粗糙，缺乏弹性。上述变化与营卫“充皮肤、肥腠理”功能下降紧密相关。补益营卫，恢复衰老成纤维细胞的增殖能力，研究影响其增殖的影响因子和作用途径，是揭示营卫“充皮肤、肥腠理”的重要内涵之一。

c-Jun癌蛋白是激活蛋白转录复合物的必需元件。与其它Jun/Fos成员通过异二聚作用形成活性激活蛋白-1复合物（AP-1），来调节不同靶基因的表达，包括它们启动子内的AP-1结合DNA元件。AP-1控制基因表达调节一些重要的细胞功能如细胞周期进展，迁移，增殖和凋亡。c-Jun由c-Jun氨基端激酶磷酸化激活，响应不同的生物应激信号［8］。c-Jun调控范围十分广泛，能被各组织中的多种化学物质激活并受其影响［9］。如癌症发生［10-11］、DNA甲基化［12］、神经再生［13］。c-Jun和Jun-B可被TGF-β家族诱导产生，在细胞分化中发挥重要作用［14］。

笔者的研究结果显示，人皮肤成纤维细胞衰老时24h和48h其c-Jun表达水平比年轻人皮肤成纤维细胞分别下降了70%和71%，72h则两者的表达水平相当。提示衰老细胞c-Jun基因表达紊乱。衰老人皮肤成纤维细胞经补益营卫药物处理后显著逆转了c-Jun基因的表达，相对于衰老人皮肤成纤维细胞，其24h、48h分别提高了4.67倍和2.12倍。而至72h其表达水平相当，说明补益营卫方对c-Jun基因表达有一定促进作用。

中和TGF-β1蛋白后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达24h和72h时，分别是年轻人皮肤成纤维细胞的2.4倍和1.7倍。而48h时，年轻人皮肤成纤维细胞的c-Jun基因表达水平却是衰老人皮肤成纤维细胞的9.2倍，提示TGF-β1蛋白对c-Jun基因表达有复杂的调节作用。衰老人皮肤成纤维细胞补益营卫药物处理后显著提高了c-Jun基因的表达，48h和72h时基因的表达水平分别是衰老人皮肤成纤维细胞的2.3倍和1.5倍，提示补益营卫方促进衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达可能存在不依赖于TGF-β1信号转导途径。

中和TGF-β1和bFGF蛋白后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达水平随着时间的不同被明显下调；与年轻人皮肤成纤维细胞相比，24h、48h和72h分别下降了64.5%、94.2%和73.7%，提示bFGF蛋白是c-Jun基因表达的重要促进因子。衰老人皮肤成纤维细胞经补益营卫药物处理后，c-Jun基因的表达随着时间的不同相对于衰老人皮肤成纤维细胞被显著上调。24h、48h和72h分别是衰老人皮肤成纤维细胞的9.7倍、3.6倍和9.8倍。说明补益营卫方对c-Jun基因表达有明显的促进作用，也提示补益营卫方对c-Jun基因表达存在不依赖于TGF-β 1蛋白和bFGF蛋白的途径。

纵向比较来看，未中和TGF-β1前，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达24h、48h和72h分别为1、3.84和4.3；中和TGF-β1蛋白后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达24h、48h和72h分别为8.13、1.16和7.38，两者对比来看，提示TGF-β1蛋白对c-Jun基因的表达存在复杂的调节作用，即可能存在双向调节作用。当TGF-β1和bFGF蛋白均被中和后，衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达24h、48h和72h分别下降为1.19、0.78和1.13，相对于只中和TGF-β1蛋白来看，c-Jun基因的表达如此剧烈的下降，提示1）bFGF蛋白是TGF-β1信号调节途径的下游蛋白；2）bFGF蛋白是c-Jun基因表达的重要促进因子。

综上所述，衰老时人皮肤成纤维细胞c-Jun基因的表达紊乱。此时TGF-β1蛋白对其的调节作用亦表现异常。补益营卫方对衰老人皮肤成纤维细胞c-Jun基因表达有促进作用，这种促进作用存在不依赖于TGF-β1蛋白和bFGF蛋白的途径，其作用机制有待于进一步研究。

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编辑/张惠娟

c-Jun Gene Expression Of The Recipe Of Supplementing Ying-wei And TGF-β1 And bFGF In the aging Human Skin Fibroblasts

ZHOU Xiao-ping，SI Xiao-wei，XU Wu-qing，YU Yang
（Traditional Chinese Medicine School of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Objective To study the c-Jun gene expression influenced by the recipe of supplementing Ying-wei and transforming growth factor-β1（TGF-β1）and basic fibroblast growth factor（bFGF）in the aging human skin fibroblasts.Methods Firstly，to copy the aging model of human skin fibroblasts by continuous passage culturing.Secondly，to detect the c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts through the fluorescent quantitative PCR method，after neutralizing antibody blocking TGF-β1 and bFGF.Results When the human skin fibroblasts aging，the expressive level of c-Jun gene，compared to that of young skin fibroblasts，falls by 70%and 71%in 24h and 48h.But theexpressive levels in 72h are both similar.As aging human skin fibroblasts treated by the recipe of supplementing Ying-wei，the c-Jun gene expression which has increased to 4.67 times and 2.12 times in 24h and 48h，has significantly improved，compared to the aging human skin fibroblasts.And the expressive levels of them are equivalent in 72h.After neutralizing TGF-β1 protein，c-Jun gene expressive level of the aging human skin fibroblasts is 2.4 times and 1.7 times as large as that of young skin fibroblasts in 24h and 72h.In 48h，the gene expressive level of young skin fibroblasts is 9.2 times as large as that of aging human skin fibroblasts.After using the recipe of supplementing Yingwei，the c-Jun gene expression of aging human skin fibroblasts has improved obviously.The c-Jun gene expressive level of human skin fibroblasts raise by 2.3 times and 1.5 times in 48h and 72h.After neutralizing TGF-β1 protein and bFGF protein，c-Jun gene expressive level is decreased obviously with different time；Compared with the young skin fibroblasts，c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts falls by 64.5%，94.2%and 73.7%in 24h，48h and 72h.As aging human skin fibroblasts treated by the recipe of supplementing Ying-wei，c-Jun gene expression has significantly increased over time.c-Jun gene expression in 24h，48h and 72h is of 9.7 times，3.6 times and 9.8 times as much as that of aging human skin fibroblasts.From the perspective of longitudinal comparison，TGF-β1 protein has a complex regulative effect on c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts.And bFGF protein has obviously promoted the c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts.Conclusion When people aging，the c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts is disorder.The recipe of supplementing Ying-wei can promote the c-Jun gene expression of the aging human skin fibroblasts；And this promotion does not depend on the access of the TGF-β1 and bFGF.bFGF protein is the downstream protein of signal regulating pathways of the TGF-β1；and is one of the important promoting factors of c-Jun gene expression.

Supplementing Ying-wei；TGFβ1；bFGF；c-Jun；skin aging

Q813.1

A

1008-6455（2015）17-0028-05

国家自然科学基金资助项目（30960479）

2015-05-02

2015-06-25