人细小病毒B19的环介导等温扩增快速检测方法的建立

张彦东，邬 巍，马 宁，刘 涛，王 凯，姜振宁

（吉林大学第一医院 风湿免疫科，吉林 长春130021）

人微小病毒B19（Human Parvovirus B19，HPV B19）是一种DNA病毒，也是与人类最密切相关的微小病毒［1］。本病毒是由Yvonne Cossart等于1975年在标记B19号HBsAg对照的血清中首次鉴定出一种微病毒颗粒。在实验室检测中最早利用特异性血清学检测，后又建立了PCR、荧光定量PCR［2］和基因芯片［3］等灵敏度较高的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂 病毒基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Axygen公司、限制性内切酶Hinf I、Dpn I和T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品，dNTPs、DL2000DNA Marker、甜菜碱（betaine）为Sigma公司产品；Bst DNA聚合酶大片段为NEB公司产品。

1.2 病毒DNA的抽提 参照DNA提取试剂盒的说明书进行病毒DNA的抽提。

1.3 引物的设计与合成 利用LAMP引物在线设计软件Primer explorer，根据登陆在GenBank中B19的VP2进行比较，选择基因保守区域，设计引物，筛选后选择2对引物，F3/B3为外游引物，FIP/BIP为内游引物。同时利用oligo软件设计1对PCR引物，上游为upper，下游为lower。各引物序列为：

所有序列由深圳华大生物技术有限公司合成。

1.4 PCR方法 按照说明书进行常规PCR方法对病毒DNA鉴定。

1.5 LAMP检测方法 对25μl反应体系中的MgSO4（25mmol/L）以及反应时间进行优化。调整试验中 MgSO4（25mmol/L）的用量，MgSO4（25 mmol/L）则为6μl，7μl，8μl；并且优化 LAMP的反应时间，分别调整为60min，90min，120min。反应体系中其他用量为：2μl的DNA样品、2.5μl的Bst DNA 聚合酶缓冲液（10×）、2μl dNTPs（10 mmol/L），1μl的 Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（5 mol/L）、对应于VP2基因的4条引物各浓度F3/B3为pmol/μl、BIP/FIP为40pmol/μl，加 H2O 补足至25μl。混匀，65℃，1－2h后80℃，2min，水浴。1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察试验结果。

1.6 LAMP产物的酶切鉴定和序列测定 将LAMP产物采用限制性内切酶BanII进行酶切鉴定，并以此为模板进行普通PCR扩增。扩增产物经回收、连接、转化，得到阳性克隆，并且送深圳华大公司基因测序。方法参照试剂盒说明书。

1.7 LAMP的灵敏性与特异性评价 将抽提所得的总DNA 10倍稀释至10－5.并使用紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为100 ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。对上述各浓度DNA用LAMP方法进行检测，并用PCR方法同时扩增进行灵敏性的比较。

按照与B19病毒相同的条件对乙型肝炎病毒（HBV），巨细胞病毒（HCMV）进行DNA的提取，以及优化后的LAMP检测。

2 结果

2.1 B19病毒的PCR结果 PCR结果可见在100 bp与250bp之间有一条阳性条带（图1），与设计的198bp产物片段符合。

2.2 MgSO4以及反应时间的优化结果 根据琼脂糖凝胶电泳结果表明 MgSO4（25mmol/L）为6μl（图2），最适反应时间为60min（图3）。

2.3 酶切鉴定及测序结果 用Hinf I和Dpn I限制性内切酶对LAMP产物进行双酶切鉴定，结果表明，本实验中的LAMP产物片段大小与理论值相符。

2.4 LAMP的灵敏性和特异性结果 常规PCR产物稀释至10pg时，PCR无结果，LAMP结果为阳性（图4），证明其灵敏性高于普通PCR。对HBV和HCMV进行特异性判断，LAMP检测结果HBV和HCMV是阴性（图4），B19病毒为阳性，证明LAMP检测方法具有特异性。

图1 b19病毒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图2 不同浓度Mg2＋离子的LAMP检测结果

图3 不同反应时间的LAMP检测结果

图4 b19病毒的琼脂糖凝胶电泳结果

3 讨论

3.1 人类细小病毒B19是一种DNA病毒，体积最小、结构简单，有报道该病毒与感染致过敏性紫癜、川崎病［4］、系统性红斑狼疮［5］、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病和关节炎等均相关。但由于人类细小病毒B19很难在常规细胞系中繁殖，也无法在建立动物模型中复制，因此对该病毒的研究有一定的限制。临床上通常根据其抗体的检测来判断患者是否感染过B19病毒，对于抗原的检测最常见的方法就是聚合酶链反应（PCR），但该方法需要特殊的仪器、摸索适合PCR条件以及较长的循环时间，并不适用于临床检测。近年来，各种等温检测技术被广泛应用［6］。本实验利用2000年日本Notomi博士发明的环介导等温扩增技术（LAMP），在国内首次建立人B19病毒LAMP检测方法，实验仅需要一台恒温水浴锅就可以在60min内完成整个检测过程，并且实验证明其敏感性高于普通PCR方法。真正达到了简单、高效的诊断检测。

3.2 LAMP检测方法中引物设计是其核心部分，也是技术关键 此方法是用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域。实验的条件是60－65℃，此温度是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态，依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。另外，很多文献报道因为LAMP检测方法的灵敏度过高，实验中很容易出现假阳性。本实验中为避免此状况，将进行扩增的空间与进行电泳的空间严格隔离，并酶切鉴定结果的特异性。如果在临床上应用，则可以添置浊度仪或加入荧光染料就可避免此问题。

［1］Torok TJ.Parvovlru8B19and Human disease［J］.Adv Intern Med，1992，37：431.

［2］赵国强，胡 军，冷 弘，等.荧光定量PCR检测B19病毒方法的建立［J］.郑州大学学报，2005，5：380.

［3］Lu liang，MA Wen－li，WANG Hong－min，et al.Quick preparations of human parvovirus B19micro array probes using PCR［J］.第一军医大学学报，2003，23（11）：1121.

［4］郑 岩.40例川崎病患儿微小病毒B19感染的近期分析［J］.中国实验诊断学，2008，6：789.

［5］鲁智勇，沈小雁，薛 峰，等.细小病毒B19感染与系统性红斑狼疮相关性研究［J］.中华风湿病学杂志，2006，10（7）：430.

［6］张福明，李 凡，张淑芹.网状分枝扩增法检测EB病毒基因及临床应用研究［J］.中国实验诊断学，2006，3：221.