基于代谢组学的隔药灸脐法治疗原发性痛经的机理研究

杨星月,马玉侠,杜冬青,高树中

(1.山东中医药大学,济南 250014;2.济南市中医医院,济南 250012)

原发性痛经(primary dysmenorrhea,PD)是指妇女在经期或行经前后出现周期性的下腹疼痛且无器质性病变[1]。PD是妇科常见疾病,在年轻妇女中患病率高达 20%～90%,严重者占 15%[2],影响患者正常的工作和学习。

西医多采用非甾体类抗炎药治疗,但存在消化系统和神经系统等方面的副反应[3-4]。课题组前期的研究表明[5-7],隔药灸脐法可显著改善 PD患者的痛经症状,但具体机制不清。本研究基于LC-MS联用的代谢组学方法探究隔药灸脐法治疗PD的机制,现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

20例受试者均来自于山东中医药大学附属医院和山东大学齐鲁医院的门诊,签署知情同意书后纳入试验。采用完全随机设计,按照1:1的比例设立隔药灸脐组和艾条灸脐组,每组10例。首先按就诊先后顺序编号,临床医师根据患者的编号向随机方案保管人员索取随机号及该患者所纳入的组别编号,然后按照各组治疗方案进行临床试验。在干预和随访过程中隔药灸脐组和艾条灸脐组各脱落2例。各组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。详见表1。

表1 两组患者年龄、病程及筛选期VAS读数比较 (x±s)

1.2 诊断标准

参照加拿大妇产科学会2005年《原发性痛经临床指南》制定的PD诊断标准拟定[8]。经期或者经行前后出现下腹部疼痛且经妇科检查无器质性病变。每个月经周期症状相似,主要为下腹部痉挛性疼痛,可向腰骶、会阴及大腿内侧放射,可伴随腹泻、恶心、呕吐、疲劳和头晕等症状。

1.3 纳入标准

①符合PD的诊断标准;②年龄在16～35岁;③月经周期规律[(28±7)d]超过 6个月;④视觉模拟评分(VAS)≥40 mm;⑤接受本疗法之前1个月经周期未接受其他治疗;⑥自愿参与并与研究者合作,签署书面知情同意书。

1.4 排除标准

①经妇科及B超检查,属继发性痛经者;②月经周期不规律者;③妊娠期和哺乳期以及有怀孕意向的患者;④有胃肠道疾病(慢性腹痛、慢性肠炎等)、妇科疾病(子宫内膜异位症、卵巢囊肿等)、内分泌疾病(脑下垂体瘤等)、精神疾病以及做过腹部或盆腔手术的患者。

1.5 剔除和脱落标准

①因疗效不佳等原因自行退出者;②无治疗记录或资料不全影响疗效判断者;③治疗期间接受其他疗法者;④治疗期间出现严重不良事件的受试者或在研究过程中出现其他严重的并发疾病或病情恶化者;⑤依从性差,未按时复诊,不能完成全程治疗者。

2 治疗方法

试验过程中,实行研究者、操作者、统计者3者分离,由不知分组情况的第3者进行疗效评价,资料总结阶段采用盲法统计分析。

2.1 隔药灸脐组

2.1.1 方药组成

吴茱萸、生白芍、乳香、没药、醋元胡、冰片、生五灵脂等,将药物超微粉碎混合,密封备用。

2.1.2 操作方法

温开水调面粉成圆柱状备用(高约2 cm,底面直径约 8 cm),在其底面垂直于横切面凿一小孔,其孔大小与患者脐大小相同,并在其上部周边捏起高约1 cm的边缘部分;令患者仰卧位,充分暴露脐部,用 75%乙醇在脐局部常规消毒后,将面圈放置脐上，其中央小孔正对脐孔,取上述药末适量(约8～10 g)填满面圈中央小孔,将艾炷(直径约1.5 cm,高约2.0 cm)置于药末上,连续施灸10壮,约2 h。灸后用医用胶布固封脐中药末,1 d后自行揭下。

2.1.3 治疗时间

每次月经来潮前7 d开始治疗,脐疗每3天1次(每个月经周期约2～3次),直至月经来潮。3个月经周期为1个疗程,1个疗程后观察疗效,并随访1个月。

2.2 艾条灸脐组

2.2.1 艾条

选用苏州市艾绒厂生产的清艾条,每支25 g。

2.2.2 操作方法

患者取仰卧位,暴露脐部,将艾条的一端点燃对准神阙穴施灸,使患者局部有温热感而无灼痛为宜,每次灸2 h。

2.2.3 治疗时间

同隔药灸脐组。

试验期间,患者若不能忍受疼痛者(VAS≥80)可加服阿司匹林泡腾片 0.5 g,由试验中心统一发放,记录服药患者例数及其服用剂量。

3 治疗效果

3.1 样本采集和指标检测

3.1.1 腹痛程度评分标准

采用国际常用的VAS评定痛经患者的腹痛程度。

3.1.2 血浆中的代谢产物测定

3.1.2.1 样本采集

20例受试者均在治疗前空白等待1个月经周期,在空白等待经期的 1～2 d内及治疗1个疗程后第 1个经期的1～2 d内各采集一次血液样本。血液加入到抗凝管中,5000 rpm离心5 min,取血浆,﹣20℃冷冻保存备用。

3.1.2.2 样本代谢组学分析

血浆样本于测定前取出,4℃下解冻,加入一定量乙腈沉淀蛋白,15000 rpm离心5 min,取上清液备测。

3.1.2.3 样本处理液相条件

配有Agilent Poroshell-120 EC-C18反相柱(粒径2.7 μm,3.0 mm×50 mm),流速 0.4 mL/min,进样室温度为4℃,柱温为35℃,进样量为5 μL。

3.1.2.4 样本处理质谱条件

电喷雾离子源(ESI源),质量扫描范围为50～1100 Da,毛细管电压3500 V,四极杆温度100℃,Fragmentor175 V,雾化压力 35 psig,干燥气温度350℃,干燥气流量10 L/min。

3.2 数据处理

原始的LC-MS检测数据不能直接用于模式识别分析,经过预处理(去噪音、除内标、峰判别、峰对齐、归一化)后,采用 Masshunter数据定量分析软件提取数据的分子峰特征,再经处理导入到Simca-P 11.5软件,进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法—判别分析(PLS-DA),利用 VIP(very important in the projection)数值变化寻找有贡献的代谢物组分。相关代谢通路信息主要来自HMDB、KEGG数据库。

3.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差表示,采用t检验;计数资料采用卡方检验。P＜0.05为有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 两组各周期VAS读数比较

图1示,两组各周期VAS值随治疗周期逐渐降低(P＜0.05),隔药灸脐组VAS读数的下降幅度大于艾条灸脐组,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 两组各周期VAS读数比较

3.4.2 两组治疗后代谢组学检测结果

两组血浆代谢组学原始谱图和数据见图 2-7。比较图2与图3,图4与图5,两组治疗后的总离子流图有明显的区别,且两组在治疗前后 PCA分析散点得分图上区分明显,说明二者的代谢产物变化在治疗前后有明显不同。

图2 隔药灸脐组治疗后血浆总离子流图

图3 艾条灸脐组治疗后血浆总离子流图

图4 隔药灸脐组治疗前后血浆PCA分析散点得分图

图5 艾条灸脐组治疗前后血浆PCA分析散点得分图

图6 隔药灸脐组治疗前后血浆PLS得分图中VIP值变化

图7 艾条灸脐组治疗前后血浆PLS得分图中VIP值变化

图6 和图7分别表示隔药灸脐组和艾条灸脐组治疗前后代谢产物的变化趋势,从左至右依次降低。以VIP＞1为标准,隔药灸脐组共找到5442种离子信息,鉴别出 4种可能的代谢物质及途径,艾条灸脐组共找到2718种离子信息,鉴别出1种可能的代谢物质及途径。详见表2。

表2 两组对分类有重要贡献的血浆代谢产物推断结果

4 讨论

目前认为,原发性痛经的主要机制为前列腺素(prostaglandin,PG)分泌过多导致痛觉过敏和炎症性疼痛[9]。痛经患者子宫内膜和月经血中 PGE2和 PGF2α含量均较正常妇女明显升高,PGF2α含量增高可引起子宫平滑肌过强收缩,血管痉挛,造成子宫缺血缺氧状态而出现痛经,且经血 PGF2α水平与痛经程度成正比[10]。雌孕激素的水平异常也是导致原发性痛经的主要病因[11-12],雌激素含量升高促进PG的合成与释放,导致血管平滑肌痉挛,此作用可被孕激素所拮抗,孕激素含量升高则缓解子宫肌痉挛,促进微循环及镇痛物质的合成释放[13]。由本研究可以看出,隔药灸脐组患者经治疗后血浆中20α-二氢黄体酮、孕烯醇酮、PGE2、γ-氨基丁酸的含量升高,雌酮、PGH2的含量降低,可调节关键代谢产物如孕激素、雌激素以及前列腺素的含量,调节范围相对较广,并与课题组前期运用生物化学方法[14]探究隔药灸脐对 PD患者生殖内分泌激素影响的结果大致相同。γ-氨基丁酸在中枢神经系统参与镇痛作用,可提高痛阈,因此,γ-氨基丁酸含量的升高也可改善患者的痛经症状。艾条灸脐法可降低5’-磷酸吡哆醛的含量,可能是通过参与神经递质的代谢,并影响下丘脑-垂体-性腺轴。由于代谢组学研究方法并不能完全反应体内物质的代谢情况,因此,此试验研究结果只是初步探究了隔药灸脐法治疗PD的有效作用靶点。

综上,隔药灸脐和艾条灸脐均可改善PD患者的腹痛症状,但是隔药灸脐法治疗PD的疗效优于艾条灸脐法,其可能是通过调节雌酮、孕酮以及前列腺素等激素水平从而发挥治疗痛经的作用。但由于本研究属基础研究,纳入受试者较少,临床统计和代谢组学检测结果数据离散度较大,同时由于代谢组学研究方法的不完善,今后尚需在目前研究的基础上,进一步扩大样本量,并结合分子生物学、影像学等研究方法对隔药灸脐法治疗PD的机制进行深入研究。

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