不同生长期穿心莲叶中6种同工酶分析△

邵艳华，高俊丽，李倩，章润菁，丁平，赖小平

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

·基础研究·

不同生长期穿心莲叶中6种同工酶分析△

邵艳华，高俊丽，李倩，章润菁，丁平*，赖小平

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

目的：研究不同生长期穿心莲叶中6种同工酶的酶谱变化规律，为探讨同工酶与穿心莲次生代谢产物形成之间的关系奠定基础。方法：以不同生长时期的穿心莲顶端全展叶为供试材料，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法得到穿心莲叶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化酶(CYT)及酯酶(EST)同工酶的电泳酶谱，对不同生长期穿心莲叶中上述6种同工酶图谱进行比较分析。结果：不同生长期穿心莲叶中6种同工酶的酶带亮度(酶活性)均随着生长时期的不同显示出明显差别，且均具有各自的主要特征酶带。POD、CYT和PPO同工酶酶谱在质(酶带数)和量(酶活性)上均表现出不同程度的差异，其酶活性在花果期显著增强，其中POD受物候期的影响最为显著；EST同工酶的酶活性也在花果期明显提高；CAT和SOD同工酶在穿心莲生长过程中相对稳定。结论：POD、EST、PPO以及CYT同工酶酶谱的变化可以明显反映不同生长期穿心莲的生长发育特异性，尤其是POD可以作为观察穿心莲生长变化以及深入研究次生代谢产物生成的一种生理指标。

穿心莲；不同生长期；同工酶

穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees为爵床科一年生草本植物，在中国、印度、马来西亚等国家的传统医学及养生保健文化中具有悠久的药用历史，广泛用于治疗感冒、痢疾、肝胆疾病及毒蛇咬伤等，现代药理研究表明其具有治疗溃疡性结肠炎、糖尿病、上呼吸道损伤、高血压、肝炎及艾滋病等作用，这些主要归功于大量存在于穿心莲叶中的穿心莲二萜内酯类化学成分[1]，前期研究表明穿心莲二萜内酯类成分随着生长时期的不同会发生质和量的变化[2-3]。同工酶为催化反应相同而结构及理化性质不同的酶的分子类型，是生物机体中的天然标记，可反映出机体里的各种变化，机体发育过程的变化可以随某些同工酶的改变而特征化，在植物生长发育过程中普遍存在同工酶的阶段特异性，其酶谱表现与生长发育阶段密切相关，且不同同工酶种类其特异性不同[4-7]，可作为研究生理和代谢产物变化的指标[8]，Morimoto等研究表明黄芩体内的过氧化物酶能催化黄芩苷生成黄芩素[9]。目前关于穿心莲不同生长期同工酶的研究尚未见报道，穿心莲生长过程中二萜内酯类化学成分的变化是否与同工酶的变化有关尚不清楚，因此本文拟通过对不同生长期穿心莲叶中的过氧化物酶(POD) 、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化酶(CYT)、酯酶(EST)等6种同工酶酶谱变化进行研究，以揭示穿心莲中不同同工酶与其生长特性的相关性，掌握穿心莲的生长发育规律，进一步了解物候期对穿心莲生理生化的影响，从而为研究同工酶与次生代谢产物合成的关系奠定基础，同时为指导穿心莲规范化种植提供科研依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BIO-RAD电泳仪及BIO-RAD mini垂直电泳槽，5417R E endorf高速冷冻离心机。

1.2 试药

试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、Tris、溴酚蓝，TEMED(广州昂科生物科技有限公司)，水为去离子水。

样品：实验用穿心莲叶采自广州中医药大学药王山穿心莲样地，经广州中医药大学丁平研究员鉴定为爵床科植物穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees。采样时间为2013年7月20日至10月4日，即分别于穿心莲快速生长期(7月)、现蕾期(8月)、花期(9月)、花果期(10月)采集样品，样品详情见表1。

表1 穿心莲样品信息

2 方法

2.1 样品制备

将采集的穿心莲嫩叶用去离子水洗净，用滤纸吸干其表面水分，称取0.5 g(每批样品取3份)，加入液氮研成粉，加入1.0 mL pH 8.0的1.0 mol· L-1Tris-HCl缓冲液冰浴研磨成浆，提取液于4 ℃离心20 min，12 000 r·min-1，吸取上清液作为粗酶液。贮于-20 ℃冰箱备用。

2.2 电泳

采用垂直板PAGE法，分离胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HCl，浓缩胶缓冲液为pH 6.7 Tris-HCl，POD、SOD和EST的分离胶、浓缩胶质量分数为10%、4%，PPO的分离胶和浓缩胶质量分数分别为10%、3.75%，CYT和CAT的分离胶质量分数为7%，CYT浓缩胶质量分数为3%、CAT浓缩胶质量分数为2.5%。电极缓冲液为pH 8.3 Tris-甘氨酸，样品按照粗酶液-40%蔗糖溶液-0.5%溴酚蓝(1∶1∶0.5)混匀，每孔加样20 μL，4 ℃条件下电泳，起始电流为10 mA，样品进入分离胶后调节电流至20 mA，溴酚蓝标志到达凝胶前沿停止电泳。

2.3 染色

2.3.1 POD同工酶染色 采用联苯胺-抗坏血酸染色法：电泳完毕，剥取凝胶，用蒸馏水漂洗数次后，放入染色液“70.4 mg抗坏血酸，20 mL联苯胺贮存液(2 g联苯胺溶于18 mL冰醋酸中再加水72 mL)，20 mL 3% H2O2，60 mL水”，约1～5 min出现清晰的过氧化物酶区带，迅速倾出染色液，用蒸馏水洗涤数次，于7%乙酸中保存。

2.3.2 SOD同工酶染色 凝胶在染色液“10 mmol·L-1pH 7.2磷酸缓冲液中含有2 mmol·L-1茴香胺、0.1 mmol·L-1核黄素”中浸泡1 h，快速水洗两次，光照5～15 min，即显示SOD活性谱带。

2.3.3 PPO同工酶染色 采用染色液“0.06% 邻苯二胺(0.01 mol·L-1草酸溶解)20 mL，0.05 mol·L-1邻苯二酚60 mL，pH 6.8磷酸缓冲液20 mL，混匀”常温下染色40 min，透明背景下出现黄色条带。

2.3.4 EST同工酶染色 染色液“坚牢蓝RR盐30 mg溶于30 mL pH 6.4的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液中，2 mL 1%α-醋酸萘酯(少许丙酮溶解，用80%乙醇配制)，1 mL 2%β-醋酸萘酯(配制同α-醋酸萘酯)，混匀即可”染色，37 ℃下暗反应10～60 min，当呈现棕红色酶带时，迅速倾出染色液，用蒸馏水漂洗，于7%乙酸中保存。

2.3.5 CYT同工酶染色 采用染色液“1%二甲基对苯二胺3 mL，1%α-萘酚(溶于40%乙醇)3 mL，0.1 mol·L-1pH 7.4磷酸缓冲液75 mL，混匀”染色，37 ℃下暗反应10～60 min，直至条带清晰时，立即倒掉染色液，用去离子水冲洗数次，立即拍照，否则天蓝色酶带会褪去。

2.3.6 CAT同工酶染色 电泳完毕，剥取凝胶，用蒸馏水漂洗数次后，浸没在0.9 mmol·L-1H2O2中10 min，然后加入2%铁氰化钾和2%三氯化铁的混合液，待条带显示，即刻拍照。

3 结果与分析

3.1 POD同工酶

不同生长时期穿心莲叶中POD同工酶PAGE电泳图见图1 (POD)，图谱显示不同生长时期穿心莲叶中POD同工酶酶带条数有明显差别，1～3号样品为生长旺盛期采集的穿心莲样品，其POD电泳结果显示出1条明显酶带，相对迁移率(Rf)约为0.2；4和5号样品为花蕾期的穿心莲叶，分离出2条明显的酶带，Rf值在0.1和0.2，在Rf值0.4处隐约可见第3条酶带；6和7号样品分别为花盛期和花果期的穿心莲叶，分离出3条酶带，Rf值0.4处的酶带亮度较4和5号样品明显增强；Rf 0.2的酶带为所有样品的共有带，且随着生长期的延长，酶带亮度加深，可作为穿心莲生长过程中的POD同工酶特征酶带，此结果说明花果期(采收期)的穿心莲叶中POD同工酶的酶活性增强，且产生新的特征酶带。

3.2 SOD同工酶

不同生长时期穿心莲叶中SOD同工酶PAGE电泳图见图1(SOD)，由结果可知，不同生长时期穿心莲叶中SOD同工酶酶带数为3条，Rf值在0.1、0.4和0.5，且其特征酶带亮度基本一致。说明穿心莲叶SOD同工酶在生长过程中较稳定。

3.3 PPO同工酶

不同生长时期穿心莲叶中PPO同工酶PAGE电泳图见图1(PPO)，由结果可知，穿心莲叶中PPO同工酶有5条酶带，Rf值在0.1、0.2、0.4、0.5、0.6，酶带亮度差异显著，Rf 0.5的酶带可作为PPO的特征酶带，且其在1号、2号和7号样品中显示较强亮度。说明PPO同工酶在穿心莲的快速生长期和花果期活性较强。

3.4 EST同工酶

不同生长时期穿心莲叶中EST同工酶PAGE电泳图见图1(EST)，由结果可知，不同生长时期穿心莲叶中EST同工酶酶带数一致，均有3条，Rf值在0.06、0.25、0.4，随着生长期的延长，EST酶带亮度增强，Rf 0.4的酶带在花盛期和花果期时才清晰可见。说明穿心莲叶中EST同工酶在花果期活性较强。

3.5 CYT同工酶

不同生长时期穿心莲叶中CYT同工酶PAGE电泳图见图1(CYT)，由结果可知，不同生长时期穿心莲叶中CYT同工酶酶带数一致，均有2条，Rf值在0.2、0.55，随着生长期的延长，CYT酶带亮度增强，尤其是Rf 0.55的酶带。说明穿心莲叶中CYT同工酶在花果期活性较强。

3.6 CAT同工酶

不同生长时期穿心莲叶中CAT同工酶PAGE电泳图见图1(CAT)，由结果可知，不同生长时期穿心莲叶中CAT同工酶酶带数一致，均有3条，Rf值在0.05、0.1、0.4，酶带亮度也基本一致。说明穿心莲叶中CAT同工酶在生长过程中相对稳定。

图1 不同生长时期穿心莲叶中6种同工酶的PAGE电泳图谱

4 讨论

本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳图直观清晰地显示了不同生长期穿心莲叶中6种同工酶的酶谱变化特征。POD、PPO、CYT、SOD及CAT为抗氧化酶系，参与植物的光合作用、呼吸作用以及次生代谢产物的生成积累，同时帮助植物抵御一些生物或非生物性胁迫[10]；EST是一类水解酶，能催化分子中的酯键，参与若干酶类的修饰、激活或钝化，并与内膜系统的发育有关[11]，同工酶的多寡和有无，与植物的不同生长发育时期及特定的生理状态等均有密切关系。POD、PPO、CYT和EST在花期至果期酶活性明显增强，此结果与穿心莲内酯类化学成分在花果期时含量最高的研究结果[3]相吻合，本研究从穿心莲抗氧化酶及酯酶活性的角度证明了穿心莲的最佳采收期。花果期穿心莲酶活性的增高及文献报道的穿心莲内酯类化学成分含量的增高可能与此时穿心莲生理代谢水平提高有关。林植芳等[12]报道水稻生理作用水平的提高与保护酶活性的升高协调一致，酶活力的增高能完全消除细胞内光合及呼吸作用所产生的活性氧或其他有害物质，从而使细胞内具备大量的剩余能量进行次生代谢产物的积累，由此亦可以猜测POD、PPO、CYT和EST同工酶的活性高低可能会影响穿心莲内酯类化学成分在植物体内的积累。此外，6种同工酶均具有各自的主要特征酶带，并存在于穿心莲生长的各个时期，表明这6种同工酶的特征酶带是穿心莲生长过程中的必须酶带，以保证穿心莲体内的活性氧以及其他导致膜结构及生理完整性受到破坏的物质维持在一个正常的动态水平。

同工酶是细胞代谢的调节者，穿心莲在花果期的各项新陈代谢功能增强，所以生物体内的酶如POD和PPO同工酶表现出明显质和量的提高，此结果符合侯连生等[13]报道的新陈代谢旺盛期的细胞内各种促进个体发育的酶含量和酶活力相对要高一些。POD同工酶在穿心莲不同生长期的变化最为明显，可以作为评价穿心莲生长特性的生理指标。本研究中POD在不同生长期穿心莲叶中的酶谱表现与Tang等[14]报道结果一致，这种同工酶酶谱的差异表现有助于探究植物在应对各种生物或非生物胁迫时同工酶所发挥的功用；CAT的稳定性较强，标志性酶带较恒定，可以作为遗传鉴定的指标；CYT是位于线粒体中能量代谢的关键酶，花果期CYT同工酶活性增高可能与此时穿心莲线粒体呼吸作用加强以维持正常生理代谢有关；EST同工酶活性的提高有利于调节作物对环境适应性的代谢过程，从而适应形态和功能的变化，顺利度过生长转型期[15-16]。

不同生长期穿心莲叶中不同同工酶的分析可为研究穿心莲的发育规律、种质资源鉴定以及培育高含量有效成分的穿心莲资源植物[17]等提供有效的生理学参数，从而指导穿心莲的规范化种植。另外，关于同工酶与穿心莲二萜内酯类化学成分变化的内在关系将在后期实验中进行。

[1] VALDIANI A，KADIR M A，TAN S G，et al.Nain-e havandi andrographis paniculata present yesterday，absent Today：a plenary review on underutilized herb of Iran’s pharmaceutical plants[J].Molecular Biology Reports，2012，39(5)：5409-5424.

[2] PHOLPHANA N，RANGKADILOK N，SAEHUN J，et al.Changes in the contents of four active diterpenoids at different growth stages inAndrographispaniculata(Burm.f.) Nees (Chuanxinlian)[J].Chinese Medicine，2013，8(1)：2.

[3] 曾令杰，梁晖，林蔚兰.穿心莲各生育期的药材质量和干物质积累动态研究[J].中成药，2007，29(6)：870-872.

[4] 丁玲，陈发棣，滕年军，等.菊花不同生长阶段不同器官POD和EST同工酶比较[J].西北植物学报，2007，27(10)：2029-2034.

[5] 张惠，赵雨，杨菲，等.不同生长时期人参根中3种氧化还原同工酶分析[J].中草药，2012，43(12)：2494-2498.

[6] 党建章，徐旭士，程为民.茶薪菇不同生长期同工酶的研究[J].中国食用菌，2001，20(1)：41-43.

[7] 任桂梅，陈国梁，高小朋，等.陕北羊肚菌不同生长期酯酶同工酶的分析[J].延安大学学报(自然科学版)，2005，24(1)：78-79.

[8] 童哲，崔郁英，汪健菊，等.小麦幼根和幼苗中几种同工酶的初步研究[J].Journal of Integrative Plant Biology，1980，22(2)：146-150.

[9] MORIMOTO S，TATEISHI N，MATSUDA T，et al.Novel Hydrogen peroxide metabolism in suspension cells of Scutellaria baicalensis Georgi[J].The Journal of Biological Chemistry，1998，273(20)：12606-12611.

[10] Abrol E，Vyas D，Koul S.Metabolitic shift from secondary metabolite production to induction of anti-oxidative enzymes during NaCl stress in Swertia chirata Buch.-Ham.[J].Acta Physiol Plant，2012，34：541-546.

[11] 高文远，李志亮，肖培根.甘草种子萌发初期的酯酶与蛋白质研究[J].中草药，1998，29(8)：553-556.

[12] 林植芳，李双顺，林桂珠，等.水稻叶片的衰老与超氧物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系[J].Journal of Integrative Plant Biology，1984，26(6)：605-615.

[13] 侯连生，许新，彭水根，等.不同生长期上海四膜虫的同工酶的比较研究[J].华东师范大学学报，1994(4)：85-89.

[14] TANG Lei，WANG Chenchen，HUANG Jiabao，et al.Comparative analysis of peroxidase profiles in Chinese kale (BrassicaalboglabraL.)：evaluation of leaf growth related isozymes[J].Food Chemistry，2013，136(2)：632-635.

[15] 毛慧玲，樊棠怀.茶薪菇不同发育期酯酶同工酶的研究[J].南昌大学学报(理科版)，2002，26(4)：375-376，380.

[16] 蔡朝晖，高山林，李萍，等.组培蒲圻贝母鳞茎形成过程中的同工酶电泳分析[J].中国中药杂志，1999，24(1)：17-19，64.

[17] 黄秀兰，杨保津，胡之璧，等.二萜醌类成分与过氧化物酶同工酶关系的初步研究[J].Journal of Integrative Plant Biology，1983，25(2)：145-148.

AnalysisonSixKindsofIsozymesinAndrographispaniculataLeafatDifferentGrowthPeriods

SHAOYanhua，GAOJunli，LIQian，ZHANGRunjing，DINGping*，LAIXiaoping

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：The influence of phonologicalstages (vegetative，squaring，flowering and fruiting stages) on six kinds of isozymes ofAndrographispaniculataleaf were investigated，which may offer references forunderstanding the relationshi Pbetween the isozymes and generation of secondary metabolites.Methods：The first fully developed leaves from the to Pwere used as thetested materials.The electrophoresis spectrums of six isoenzymes including peroxidase (POD)，superoxide dismutase (SOD)，Polyphenol oxidase (PPO)，Catalase (CAT)，Cytochrome Oxidase (CYT) and esterase (EST) were obtained by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) method and then analyzed consequently.Results：The aforementioned isozymes showed significant difference with different phonological stages.The number of POD，EST，CYT and PPO enzyme band and their band intensity increased at flowering and fruiting period，around September and October.POD was affected most significantly.While CAT and SOD werestable during the growth period.Conclusion：Thechanges of POD，EST，CYT and PPO isoenzyme pattern，especiallythe POD can clearly reflect the growth and development specificity ofA.paniculataat different growth period，and itmay be used as aphysiological and chemical index for the further study ofA.paniculata.

Andrographispaniculataleaf；different growth periods；isozymes

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.010

2015-01-13)

“十二五”国家科技支撑计划(2011BAI01B01)

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丁平，研究员，研究方向：中药资源有效成分及中药质量评价；E-mail：dingpinggz@126.com