山羊角药材的HPLC指纹图谱研究△

康馨元，刘睿，李春楠，钱大玮，孙佳明，段金廒，张辉*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

·基础研究·

山羊角药材的HPLC指纹图谱研究△

康馨元1，刘睿2，李春楠1，钱大玮2，孙佳明1，段金廒2，张辉1*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

目的：建立山羊角药材的HPLC指纹图谱。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脱；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL·min-1。结果：建立了10个不同产地山羊角药材的共有图谱，确定了10个共有峰，采用液质联用技术指认了其中4个共有峰，并采用聚类分析、主成分分析、相似度分析的方法对指纹图谱进行了分析。结论：该方法简便快速、专属性强，可用于山羊角药材的鉴别和评价。

山羊角；高效液相色谱法；指纹图谱

山羊角为牛科山羚属动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke、山羊属动物北山羊CapraibexLinnaeus的角。其首载于《本草新编》，曰其“专活死血”[1]。《吉林中草药》指其能镇静、退热、明目、止血[2]。山羊角主要有甾族、磷脂类、角蛋白、多肽及氨基酸类成分，与羚羊角的化学成分相似。研究表明，山羊角具有解热、镇静、催眠[3]、镇痛[4]、解痉、降压等作用，且镇静作用较羚羊角稍强[5]。

目前，对于山羊角的研究大多集中在与羚羊角进行药理作用及性状上的比较和鉴别[3-7]，鲜有单独针对山羊角的报道[8-10]。由于山羊角药材粉末颜色均不统一，易与其他角类药材相混淆，故本试验收集3种可能作为山羊角混伪品的药材进行对比分析。采用高效液相色谱法建立不同产地山羊角药材的指纹图谱，采用液质联用技术对主要色谱峰进行指认，综合运用相似度分析、聚类分析以及主成分分析方法对山羊角及其伪品色谱图进行分析，为山羊角的鉴别提供依据，为山羊角的广泛应用奠定基础。

1 仪器及材料

1.1 仪器、试剂

1260系列高效液相色谱仪[包括二极管阵列检测器(DAD)、化学工作站、自动进样器]、1100 series LC-MS液质联用仪[包括Agilent SL 型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)、自动进样器、Chemistation 化学工作站等](美国Agilent公司)、HS2060型超声波清洗器(HENGAO T&D)；BSA124S-CW型万分之一电子天平(Sartorius)。

对照品尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为100469-201302，140661-200903，110887-200202，100879-200202)；乙腈为色谱纯(Fisher公司)；水为二次蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.2 药材

山羊角药材来源于浙江、河北、江苏、广东、黑龙江、内蒙古、安徽7省共10个地区，由东丰制药有限公司提供，由长春中医药大学中医药与生物工程研发中心张辉教授鉴定为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，见表1。伪品包括水牛角(吉林大药房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及绵羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角药材来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取山羊角粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5 mL水，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱质谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱，见表2。

表2 山羊角高效液相指纹图谱梯度洗脱方式

2.2.2 质谱条件 电离源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：正负离子检测；扫描范围：m/z 50～800；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9 mL·min-1；雾化气压强：0.24 Mpa；毛细管电压：4 kV。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验 取供试品溶液(7)，分别在0、2、4、6、8、12 h进行检测，考察各主要色谱峰与内参比峰保留时间的一致性，各主要色谱峰相对保留时间RSD均小于0.61%，相对峰面积RSD均小于2.87%。通过“中药指纹图谱相似度计算软件(2004A)”计算，相似度均大于0.995，表明供试品在12 h内稳定性良好。

2.3.2 精密度试验 取供试品溶液(7)，连续进样6次，考察各主要色谱峰与内参比峰保留时间的一致性，各主要色谱峰相对保留时间RSD均小于0.10%，相对峰面积RSD均小于2.20%。通过“中药指纹图谱相似度计算软件(2004A)”计算，相似度均大于0.999，表明供试品进样精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取供试品(7)6份，同法检测，考察各主要色谱峰与内参比峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，各主要色谱峰相对保留时间RSD均小于0.20%，相对峰面积RSD均小于4.88%。通过“中药指纹图谱相似度计算软件(2004A)”计算，相似度均大于0.998，表明本法重复性良好。

2.4 样品测定

按2.1项下方法制备10批供试品溶液，分别吸取10 μL，按2.2.1项下的色谱条件注入高效液相色谱仪，进行分析。选择10个共有色谱峰，将色谱图导入“中药指纹图谱相似度计算软件(2004A)”，生成共有模式。取供试品溶液10 μL，按2.2.2项下的质谱条件注入液质联用仪，进行检测，结合色谱峰的紫外色谱图、一级质谱数据和二级质谱数据进行分析，指认出3、5、6、9号峰分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺苷，见图1。指认结果见表3。

2.5 山羊角指纹图谱的建立及分析

2.5.1 内参比组分的选择 为消除测定结果的系统误差，选定峰形对称、峰面积较稳定的保留时间为11.3 min的7号色谱峰作为内参比组分，以便计算同种山羊角的共同特征组分的相对保留时间和相对峰面积值。结果见表4～5。

注：A.共有模式色谱图；B.已知化合物色谱图；3.尿嘧啶；5.次黄嘌呤；6.尿苷；9.腺苷。图1 山羊角药材的共有模式图及已知化合物的高效液相色谱图

表3 山羊角色谱峰的HPLC-DAD-ESI-MS(n)分析结果

表4 山羊角样品10个共有峰的相对保留时间 /min

表5 山羊角样品10个共有峰的相对峰面积

2.5.2 特征指纹图谱的建立 采用国家药典委员会的“中药指纹图谱相似度计算软件A版”进行数据分析处理，设定安徽合肥的山羊角药材图谱为参照图谱，将其他样品测得的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成山羊角指纹图谱共有模式，见图2。不同产地山羊角药材指纹图谱存在一定的差异，其共有峰相对保留时间基本一致。

注：S1～S10.1～10号样品；R.对照图谱。图2 10批山羊角药材的高效液相色谱图

2.5.3 主成分分析 应用SPSS统计学软件，将山羊角药材指纹图谱的特征峰数据化(特征数据化结果为峰面积与相同峰平均峰面积之比)，输入SPSS 17.0软件，对10个共有峰进行主成分分析。第一主成分以3、5、8、7、2为主，占信息量的38.694%；第二主成分以9、6、5号峰为主，占信息量的18.952%；第三主成分以7、5、4为主，占信息量的17.550%。前3个主成分累计贡献率为75.196%，基本反映了总体信息。由相关文献[11]可知，根据各个峰在3个主成分中的总分量可计算出各个峰的权重，权重较高的峰所代表的成分在山羊角中的含量可作为分析、优选山羊角药材的指标。通过计算，排在前几位的依次为9、7、5、3号峰，见表6。由2.4项下特征峰的指认结果可知，此4个峰除未知的7号峰之外，全部为核苷成分。

表6 公共因子载荷矩阵表

2.5.4 聚类分析 聚类分析[12]是一种无监督的模式识别方法，依据样品或变量在性质上的亲疏程度进行分类。应用SPSS统计学软件，将山羊角样品及伪品药材指纹图谱的特征峰数据化，输入SPSS 17.0软件，进行聚类分析，见图3。

注：1.安徽合肥；2.河北保定；3.广东电白；4.河北安国；5.浙江金华；6.浙江缙云；7.黑龙江鸡西；8.内蒙古阿拉善；9.浙江绍兴；10.江苏盱眙；11.绵羊角；12.牛蹄甲；13.水牛角。图3 山羊角及伪品药材指纹图谱聚类分析结果

聚类分析图反映的是各样品的相似程度，样品间的分类距离越小，则样品间的差异越小，反之则越大[13]。当距离标尺在1时，样品3、9归为一类；当距离标尺在2时，样品3、9与样品5聚为一类；当距离标尺在3时，样品2、4聚为一类；当距离标尺在4时，样品6、8聚为一类；当距离标尺在5时，样品3、9、5与样品1聚为一类；当距离标尺在9时，样品10与3、9、5、1聚为一类；当距离标尺在11、12时，样品3、9、5、1、10依次与样品2、4以及样品6、8聚为一大类；当距离标尺在14时，样品7与其他所有产地山羊角药材聚为一类；而伪品13、12、11的距离标尺均大于17。聚类结果呈现一定的规律，相邻的浙江、安徽、江苏省山羊角药材首先聚为一类，再依次与河北省、内蒙古山羊角药材聚为一类，最后与黑龙江省药材聚为一类，由南向北依次聚类。以距离标尺为考察指标，可以看出山羊角样品与伪品区别明显。

2.5.5 指纹图谱相似度计算 应用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件，校正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，生成对照图谱，进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过软件得出山羊角HPLC指纹图谱共有模式，与共有模式比较，得出10批不同产地山羊角的相似度。结果表明，10批山羊角药材中除第1、3、10批药材的相似度低于0.90外，其他7批药材指纹图谱的相似度均在0.90以上，指纹图谱相似度均较高，见表7。

2.5.6 指纹图谱专属性分析 取绵羊角、牛蹄甲、水牛角药材粉末，分别以2.1项下的方法制备供试品溶液。各吸取10 μL，按2.2.1项下的色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，结果见图4。由图可知，三者的色谱图与山羊角药材色谱图有显著差别。

表7 山羊角药材指纹图谱的相似度

与山羊角药材指纹图谱的共有峰相比，绵羊角未检测出6、8、9号共有峰，牛蹄甲未检测出6、9号共有峰，水牛角未检测出9号共有峰。除色谱峰数量差异外，色谱峰峰面积也存在较大差异。因此，山羊角药材指纹图谱的建立为有效地鉴别混伪品绵羊角、牛蹄甲以及水牛角提供了依据。

注：A.绵羊角；B.牛蹄甲；C.水牛角。图4 伪品高效液相色谱图

3 讨论

笔者通过对色谱柱、流动相、检测波长以及洗脱程序的详细考察，所采用的色谱条件对山羊角药材分离效果较理想。并通过精密度、稳定性、重复性试验进行方法学考察，结果显示该方法稳定可靠、重复性好，可用于山羊角药材的高效液相指纹图谱研究。

本文首次建立山羊角药材高效液相指纹图谱，并指认出4个特征峰，分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷和腺苷。指纹图谱显示，10批样品色谱峰的整体相貌大致相同，都出现了相应的特征性成分峰，大部分药材指纹图谱的相似度在0.90以上，安徽合肥、广东电白、江苏盱眙药材的相似度在0.8以上，不同产地的指纹图谱仍存在一定的差异。共有峰主成分分析结果可知，核苷成分在区分不同产地山羊角药材中起到重要作用，可作为评价山羊角药材质量的指标成分。

通过专属性分析及聚类分析，将山羊角药材及其伪品进行了有效区分，与山羊角指纹图谱共有峰相比，各伪品均有未检测出的共有峰。在聚类分析中伪品与10批山羊角样品分类距离较大，差异明显。且不同产地样品也呈现一定的规律，地理位置越接近的药材分类距离越小，相似度越高，呈现由南向北依次聚类的规律。说明地理位置是山羊角化学成分形成的重要影响因素。

本方法建立的指纹图谱可快速地对山羊角伪品与正品进行鉴别和区分，并通过对不同产地的山羊角药材指纹图谱进行综合宏观分析，为山羊角药材质量评价及控制提供依据，为山羊角的广泛应用奠定基础。

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StudyonHPLCFingerprintofCaprahireusLinnaeus

KANGXinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，QIANDawei2，SUNJiaming1，DUANJinao2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To set u Pthe HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus.Methods：The separation was performed by HPLC.Venusil ASB C18(4.6×250 mm，5 μm)column was used with mixture of 0.1% formic acid-water and acetonitrile as mobile phase in gradient mode.The detection wavelength was 254 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1.Results：The HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus collected from ten different sources was set up.There were ten common peaks，four of witch had been identified by HPLC-DAD-ESI/MS/MS.The fingerprint was analyzed with methods of cluster analysis，principal component analysis and similarity computation.Conclusion：The method is simple，rapid and can be used for identification and evaluation ofCaprahireusLinnaeus.

CaprahireusLinnaeus；HPLC；fingerprints

2014-08-15)

角类动物药的标准制定项目—国家药品标准提高暨2015版药典科研任务(2012)

*

张辉，博士生导师，教授，研究方向：天然药物化学；E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.010