人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及分析△

吕静，李珂珂，李争宁，弓晓杰*，陈丽荣，魏汉莲

(1.大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；2.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622；3.辽宁政法职业学院 食品药品安全系，辽宁 沈阳 110161)

·基础研究·

人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及分析△

吕静1，李珂珂2，李争宁1，弓晓杰2*，陈丽荣1，魏汉莲3

(1.大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；2.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622；3.辽宁政法职业学院 食品药品安全系，辽宁 沈阳 110161)

目的：研究人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及产物结构，建立其高效液相分析方法。方法：采用对葡萄糖基6-位保护-去保护的方法，得到除糖基6-位未乙酰化的化合物K衍生物1c；利用一维核磁(1D NMR)、二维核磁(2D NMR)及质谱(MS)方法对合成产物1c进行结构鉴定；利用反相高效液相色谱，建立了人参皂苷化合物K乙酰化衍生物1c的分析方法。结果：人参皂苷化合物K乙酰化产物1c的得率为46.4%，在高效液相色谱中与其他杂质的分离度较好，分析时间在45 min以内。结论：首次采用人参皂苷化合物K葡萄糖基6-羟基保护的路线，合成其乙酰化衍生物1c，并归属了衍生物的NMR数据。采用HPLC可以快速高效地进行人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的分析。

人参皂苷化合物K；乙酰化；高效液相

人参作为一种传统中药，在中国、韩国、日本等被广泛应用，其主要活性成分是人参皂苷。人参皂苷具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病等[1-2]。近年来，人参皂苷化合物K由于独特的生物活性引起了广泛关注，其为口服人参后肠道菌群代谢的主要产物之一，能够抑制人结肠癌及肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡[3-4]，具有较好的抗炎作用[5]。20世纪日本学者研究发现，肠道菌群的代谢物化合物K及其脂肪酸酯类化合物是人参发挥实际药效的成分[6-8]。众多学者针对这一理论，开展了合成人参皂苷衍生物的研究[9-10]，从而改善分子结构，提高其活性作用。目前，通过选择性保护策略，合成了多种化合物K的酯化产物，与底物相比，其抗肿瘤作用显著提高[11-13]。

本文采用选择性保护-去保护的策略，合成了除葡萄糖基6-位外的全乙酰化产物，利用NMR对其结构做了详细表征，并通过反相高效液相色谱法，定性分析了终产物的构成，为化合物K的结构修饰和产物分析提供了新思路。

1 仪器、试剂和材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(分析型Agilent 1260)；制备型LC 3000(北京创新通恒科技有限公司)；电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；ETS-D4加热磁力搅拌器(德国IKA公司)；核磁共振仪Bruker AVANCE DRX-500型(Bruke公司，1H-NMR 400 MHz/13C-NMR 100 MHz，TMS内标)；LC-MS-2010EV电喷雾离子肼质谱仪(日本Shimadzu)。

1.2 试剂

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、三乙胺、氯化铵、乙酸酐、四氢呋喃、碳酸氢钠、无水亚硫酸钠、叔丁基二苯基氯硅烷、四丁基氟化铵(分析纯，中国化工集团)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA)；水为超纯水。

1.3 材料

人参皂苷化合物K(大连富生天然药物有限公司，批号：20100321)经NMR及MS测定纯度为98%；硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)。

2 方法和结果

2.1 衍生物的合成

2.1.1 化合物K葡萄糖基6-羟基的保护 在装有电磁搅拌器的25 mL休良克瓶中，加入化合物K 100 mg(0.160 5 mmol)(1)，用1 mL三乙胺溶解，氮气保护，冰水浴下加入叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)210 μL(0.802 7 mmol)，反应10 min后，升至室温，薄层色谱法监测反应进程。12 h反应完毕后，加入饱和氯化铵溶液停止反应。反应产物用二氯甲烷萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有机相，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，浓缩溶剂，柱层析纯化(甲醇-二氯甲烷洗脱)后得到产物1a125 mg。

2.1.2 化合物K羟基乙酰化 在装有电磁搅拌器的25 mL休良克瓶中，加入100 mg(0.116 1 mmol)化合物K的葡萄糖基6-羟基的保护产物1a和0.7 mg(0.005 8 mmol)4-二甲氨基吡啶，用2 mL三乙胺溶解，氮气保护，冰水浴下加入乙酸酐219 μL(2.322 mmol)，反应10 min后，升至室温，薄层色谱法监测反应进程，24 h反应完毕后，加入饱和碳酸氢钠(NaHCO3)溶液停止反应。反应产物用二氯甲烷萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩溶剂，柱色谱纯化(乙酸乙酯-石油醚洗脱)后得到产物1b101 mg。

图1 人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成路线

2.1.3 化合物K乙酰化衍生物的合成 将65 mg上述人参皂苷化合物K的硅醚全乙酰化产物1b65 mg(0.060 7 mmol)，加入到50 mL的圆底烧瓶中，用2 mL无水四氢呋喃溶解，冰水浴下加入四丁基氟化铵(TBAF)18 μL(0.060 7 mmol)，反应30 min后升至室温，薄层色谱检测反应进程。反应8 h后完成，减压浓缩除掉四氢呋喃，加入等体积乙酸乙酯和水共2 mL溶解。反应产物用乙酸乙酯萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩溶剂，柱色谱纯化(乙酸乙酯-石油醚洗脱)后得到化合物K乙酰化衍生物1c32 mg。合成路线图见图1。

2.2 化合物K乙酰化衍生物的结构解析

1a：乳白色粉末。ESI-MS：m/z883.5501(C52H80NaO8Si [M+Na]+；计算值883.5520)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：7.68(4H，m)，7.39(6H，m)，4.53(1H，d，J=6.1 Hz，H-glc-1)，5.11(1H，t，J=5.7 Hz，H-24)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：苯环上碳，135.5(2个C)、133.1(4个C)、129.6(4个C)、127.7(2个C)；131.2(C-25)；124.7(C-24)；96.9(C-glc-1)；73.4(C-glc-2)；78.8(C-glc-3)；71.1(C-glc-4)；75.6(C-glc-5)；64.3(C-glc-6)。

1b：乳白色粉末。ESI-MS：m/z1093.6042(C62H90NaO13Si [M+Na]+；计算值1093.6048)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：4.50(1H，d，J=7.8 Hz，H-glc-1)，5.14(1H，t，J=7.7 Hz，H-24)，7.66(4H，m)，7.37(6H，m)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：苯环上碳，135.7(2个C)、133.2(4个C)、129.7(4个C)、127.7(2个C)；131.3(C-25)；124.6(C-24)；94.7(C-glc-1)；73.8(C-glc-2)；75.3(C-glc-3)；68.8(C-glc-4)；74.4(C-glc-5)；62.8(C-glc-6)。

1c：乳白色粉末。ESI-MS：m/z855.4864(C46H72NaO13[M+Na]+；计算值 855.4871)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)和13C-NMR(CDCl3，100 MHz)。见表1。

表1 人参皂苷化合物K乙酰化衍生物1c的1H和13C-NMR数据(400 MHz in CDCl3)

注：COOCH3中甲基的1H和13C-NMR信号重叠严重，较难归属连接位置，δC20.7(δH2.08)，δC20.8(δH2.07)，δC20.8(δH2.05)，δC21.3(δH2.03)，δC21.8(δH1.97)。

2.3 化合物K乙酰化衍生物1c高效液相色谱条件的确定

2.3.1 色谱柱的选择 分别采用Agilent C18不同长度及型号的色谱柱进行合成产物的分离试验。综合结果，本试验选用Zorbax Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，可以达到较好的色谱分离效果。

2.3.2 检测波长的选择 产物1c采用DAD检测器进行，190 ～ 400 nm检测时，发现在203 nm下有最大吸收[14]。因而采用203 nm作为检测波长。

2.3.3 流动相的选择 根据产物1c的结构特征，在乙腈-水体系和甲醇-水体系之间进行了筛选。从分离度和峰形来看，70%乙腈-水体系较适合作为分离含有1c的合成产物的流动相。

2.3.4 柱温的选择 考查了不同温度下的衍生物分离度，结果发现，柱温为25 ℃时分离效果较好。

2.4 化合物K乙酰化衍生物1c高效液相色谱分析

将上述2.1.3合成的终产物，在未经硅胶柱色谱纯化时制备成质量浓度为5.0 mg·mL-1的甲醇溶液，利用高效液相色谱分析其产物情况。终产物经0.45 μm微孔滤膜过滤后，采用2.3的色谱条件，进样10 μL，得到了含1c合成产物色谱图，见图2。

图2 人参皂苷化合物K乙酰化衍生物的液相色谱图

从色谱图中可以看出，脱保护基后的产物有6个，其中第4号出峰即为目标产物1c。根据峰面积百分比计算法，其占产物含量的23.5%。见表2。

2.5 化合物K乙酰化衍生物1c合成产率的计算

投入人参皂苷化合物K 100 mg，分离纯化后得到1a125 mg，可以得出第一步反应的产率为90.4%。第二步乙酰化反应投入1a100 mg，分离纯化后得到目标产物1b101 mg，产率为81.4%。最后脱保护基的反应投入1b65 mg，分离纯化后得到乙酰化产物1c32 mg，脱保护反应产率为63%。综合以上3步反应，合成化合物K乙酰化衍生物1c的总得率为46.4%。

表2 人参皂苷化合物K乙酰化衍生物合成产物的出峰时间及相应峰面积百分比

3 讨论

本论文为了达到选择性保护伯羟基的目的，设计了使用硅烷保护基保护的方案，流程为保护-全乙酰化-脱保护。该方法反应条件温和，选择性好，反应底物无毒性，大大地降低了分离的难度，为后续试验提供方法和依据。

产物1c的5个乙酰基中各个甲基的氢谱和碳谱数据通过异核单量子相干相关谱(HSQC)得到了较好的指认，但其取代位置由于信号重叠严重，在异核多键相关谱(HMBC)中较难归属清楚，因此未指定具体连接位置。

综上，本文通过对葡萄糖基6-位选择性保护的策略，首次高效率地合成了化合物K乙酰化衍生物，并通过NMR详细归属了其氢谱和碳谱数据。利用HPLC对终产物的组成进行了定性分析，建立的分析方法可以用于目标产物的分离纯化。本文在终产物的纯化中利用了硅胶柱色谱，在今后大量制备中，为减小损失量并提高纯度，可以参考此方法用于HPLC制备分离。

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SynthesisofginsenosidecompoundKacetylatedderivativeandHPLCanalysis

LYUJing1，LIKeke2，LIZhengning1，GONGXiaojie2*，CHENLirong1，WEIHanlian3

(1.CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，DalianUniversity，Dalian116622，China；2.CollegeofMedical，DalianUniversity，Dalian116622，China；3.Department of food and drug safty，Liaoning vocational college of political science and law，Shenyang110161，China)

Objective：To synthesize and structural analyze ginsenoside compound K acetylated derivative，and establish a HPLC method for the derivative.Methods：Using the protection-deprotection strategy on the 6-OH of glucosyl，ginsenoside compound K derivatives 1c was synthesized with acetylated except 6-OH of glucosyl，and the structure of 1c was identified by 1D NMR，2D NMR and MS.The analysis method of the end-product was established by RP-HPLC-DAD，and optimized.Results：Taking all the three steps of the synthesis of 1c into account，the yield was 46.4%.In the end-product，1c showed good separation with other impurity substances，the analysis time of 1c was less than 45 minutes.Conclusion：Using the protection strategy on the 6-OH of glucosyl，we synthesized compound K acetylated derivatives for the first time，and provided the comprehensive NMR data.The HPLC method can provide a rapid and efficient method to determination of the end-product.

Ginsenoside compound K；acetylated；HPLC

2015-04-10)

国家自然科学基金(81172949)；辽宁省教育厅科学技术研究一般研究项目(L2012439)；辽宁省优秀人才支持计划(LR2013058)；辽宁省科技厅科学技术计划项目(2014204007)；大连市科技局科技计划项目(2014E12SF071)

*

弓晓杰，教授，硕士生导师，研究方向：中药新药开发；E-mail：gxjclr@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.005