沙苑子与其混伪品的ITS序列分子鉴别研究△

张乐，朱虹，2，韦坤华，张春红，2，李旻辉，2*

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头 014060；3.广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023)

·基础研究·

沙苑子与其混伪品的ITS序列分子鉴别研究△

张乐1，朱虹1，2，韦坤华3，张春红1，2，李旻辉1，2*

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头 014060；3.广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023)

目的：研究沙苑子与其混伪品之间的DNA分子鉴别方法。方法：采集不同产地的沙苑子药材10份，基原植物2份，达乌里黄芪3份，蒙古黄芪4份，直立黄芪3份，混伪品猪屎豆和凹叶野百合各1份，所有样品进行总DNA的提取，PCR扩增，并对扩增产物进行测序得到相应的序列，用MEGA计算其种间的K-2-P距离，最后利用ITS序列构建其系统发育树。结果：测得了24份样品的ITS序列全长，分别为沙苑子644～688 bp，蒙古黄芪为646～673 bp；直立黄芪685～687 bp；达乌里黄芪为676～688 bp；猪屎豆为785 bp；凹叶野百合为837 bp。通过以ITS序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将沙苑子与其混伪品有效的区分开。用MEGA软件基于ITS序列构建的沙苑子与其混伪品间的遗传距离分析得到了沙苑子与达乌里黄芪的种间K-2-P距离0.080 2；蒙古黄芪为0.081 2，与直立黄芪之间的遗传距离为0.082 4，凹叶野百合和猪屎豆与沙苑子的遗传距离稍大，达到0.236 2和0.229 9。用MEGA软件测定沙苑子种内遗传距离为0.001 0。此外，对通过测定种间的遗传距离发现，蒙古黄芪与直立黄芪种间的遗传距离最小为0.000 9，与猪屎豆种间的遗传距离最大为0.236 2。结论：ITS序列能够成功鉴定沙苑子及其混伪品，可以作为沙苑子与其混伪品的分子鉴别方法。

沙苑子；ITS序列；分子鉴别

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪AstragaluscomplanatusR.Br.的干燥成熟种子，为临床常用中药，始载于《神农本草经》。传统中医药理论认为沙苑子具有温补肝肾、固精、缩尿、明目的功能，用于肾虚腰痛、遗精早泄、白浊带下、小便余沥、眩晕目昏等[1]。随着沙苑子有效成分的深入研究，沙苑子资源广泛开发和利用，市场对沙苑子资源的需求急剧增加。通过调查发现近年来市场上除了正品沙苑子外，尚有伪品和混淆品存在，如直立黄芪种子、达乌里黄芪种子、蒙古黄芪种子、猪屎豆种子、凹叶野百合种子等，这些药材在外形上与沙苑子极为相近，但在药效方面相差甚远，有些甚至具有毒性。因此，准确的鉴别沙苑子药材对于保障人们用药安全意义重大。

市面上销售的沙苑子大多为加工过的药材。由于沙苑子与其混伪品的性状、显微特征等都极为相似，因此在实际运用中要准确鉴别存在一定难度。同时应用形态学、组织学和化学成分分析等方法来鉴定沙苑子，具有主观性较强、特异性较弱、通用性差、对观察者经验要求高等缺陷，不利于规范化、标准化方法的建立及普及。而DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，为药材的鉴别提供了客观而有效的手段[2-6]。本研究采用rDNA-ITS序列差异分析的方法，对沙苑子药材和基源植物及其混伪品猪屎豆、达乌里黄芪、直立黄芪，蒙古黄芪和凹叶野百合的遗传关系作深入的研究，为准确进行沙苑子与其混伪品的鉴别提供科学的客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 PCR仪(德国Eppendorf型号5332)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号DYY-12)，低温冷冻离心机(德国Eppendorf 型号5810 R)，紫外凝胶成像分析仪(英国Syngene型号GBOXHR)，混合型球磨仪(德国Retseh 型号MM400)，数控超声波清洗器(型号KQ-SOODE)，微量移液器(德国Eppendorf)。

1.1.2 试剂 2 x CTAB提取液，1 x TAE缓冲液，琼脂糖(Promega公司)，溴化乙锭(Flulka公司)，DNA Tag聚合酶(Takara公司)，2000 bp DNA Markar(Takara公司)，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。

1.1.3 供试样品 实验材料沙苑子种子及原植物、猪屎豆种子、达乌里黄芪种子、直立黄芪种子，蒙古黄芪种子等样品均经内蒙古科技大学包头医学院李旻辉教授鉴定，采集信息见表1。沙苑子通常略呈肾形而稍扁，长2～2.5 mm，宽1.5～2 mm，厚约l mm。表面光滑，褐绿色或灰褐色，边缘一侧微凹处具圆形种脐。质坚硬，不易破碎。子叶2，淡黄色，胚根弯曲，长约l mm。气微，味淡，嚼之有豆腥味。通过与当地药材商进行核实确定，并根据药材商进货时留下的收据信息来核对样品，进而保证对广西、四川、河北等三个不同地区的沙苑子收集的准确性。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA提取 取每份样品单粒种子0.3 mg，研磨破碎装入微量离心管中，加入适量预热的2 x CTAB提取液，用振荡器将样品摇匀，加入适量巯基乙醇，混匀，放在65 ℃水浴锅中水浴1.5 h，取出材料置于室温下冷却，加入适量氯仿-异戊醇(24∶1)溶液，用力摇匀5 min，高速离心10 min(12 000r·min-1)，取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)溶液，用力摇匀 5 min，高速离心10 min，取上清液，加入适量异丙醇，轻轻颠倒2-3次，放在-20 ℃冰箱里静置30 min，高速离心10 min，弃上清，用70%乙醇及无水乙醇分别洗2次，最后放在37 ℃烘箱中烘20～30 min，使乙醇挥发彻底，加入适量灭菌蒸馏水，使之溶解，放在-20 ℃或4 ℃冰箱中保存备用。

表1 实验材料采集地

1.2.2 引物设计 选择目前国际推荐的通用引物ITS(ITS4/ITS5)。

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′；

ITSS：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAGG-3′。

1.2.3 DNA扩增 反应体系总体积为25 μL，包括10 x buffer缓冲液2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物各2.5 μL，ExTag酶0.2 μL，DNA 1 μL，灭菌蒸馏水19.8 μL。反应条件：解链温度95 ℃，时间5 min，退火温度56 ℃，时间30 s，复性温度72 ℃，时间1 min 40 s，延伸温度72℃，时间7 min，循环次数为35个，最后4 ℃保存。

1.2.4测序 经过PCR扩增后，PCR原产物由北京擎科新业生物技术有限公司测序部测序，各样品均采用双向测序。

1.2.5 序列分析 将6种药材的24个个体进行序列的比对分析，所得DNA序列用CONTIG软件同源对齐，并辅以人工校对。以尽量减少排列所缺失的数口；排序后的序列使用BioEdit分析软件进行分析处理。用MEGA 5分别计算各样品ITS序列的差异性(Kimura 2-parameter)，并采用邻接法(NJ法)和非加权平均法(UPGMA法)分别构建了系统发育树。构建系统发育树，并以Bootstrap作1000次可信度分析。

2 结果与分析

2.1 沙苑子与其混伪品的ITS序列特征

本实验测得了沙苑子与其混伪品的24份样品ITS序列，ITS全序列长度为644～837 bp，分别为沙苑子644～688 bp，其中(G+C)%为52.69%～53.34%；蒙古黄芪为646～673 bp，其中(G+C)%为46.51%～53.08%；直立黄芪685～687 bp，其中(G+C)%为52.11%～52.4%；达乌里黄芪为676～688 bp，其中(G+C)%为51.74%～52.42%；猪屎豆为785 bp，其中(G+C)%为58.22%；凹叶野百合为837 bp，其中(G+C)%为54.96%。

2.2 沙苑子与其混伪品间的遗传距离分析

用MEGA软件基于ITS序列构建的沙苑子与其混伪品间的遗传距离分析得到了沙苑子与其混伪品蒙古黄芪、直立黄芪、达乌里黄芪、凹叶野百合及猪屎豆间的种间K-2-P距离，其中达乌里黄芪与沙苑子的种间K-2-P距离最小(0.080 2)；其次是蒙古黄芪为0.081 2)，直立黄芪与沙苑子之间的遗传距离为(0.0824)，凹叶野百合和猪屎豆与沙苑子的遗传距离稍大，达到0.236 2和0.229 9。(见表2)用MEGA软件测定沙苑子种内遗传距离为0.001 0。通过测定混伪品间K-2-P距离发现，蒙古黄芪与直立黄芪种间的遗传距离最小为0.0009，与猪屎豆种间的遗传距离最大为0.236 2(见表3)。

2.3 沙苑子与其混伪品系统发育树构建

为了尽可能减少因系统误差对所构建系统树的影响，本实验根据ITS序列特征采用NJ法和UPGMA法分别构建了系统发育树(图1及图2)。

表2 基于ITS序列构建的沙苑子与其混伪品间的遗传距离

表3 基于ITS序列构建的混伪品的种间距离

图1 基于ITS序列构建的沙苑子及混伪品的NJ树

图2 基于ITS序列构建的沙苑子与其混伪品的UPGMA树

2种方法均采用Kimura 2-parameter距离，系统树各分支的置信度用自展法(bootstrap method)检验，共进行1000次循环，以评价分支的统计学意义与可靠性。由图1可以看出，通过NJ法建立的系统树进行聚类可以分成3个大组，第1大组为不同产地沙苑子，第2大组为直立黄芪、达乌里黄芪及蒙古黄芪，其中直立黄芪和达乌里黄芪体聚在了一起，蒙古黄芪和直立黄芪以及达乌里黄芪能够分开，第3大组为猪屎豆和凹叶野百合，其中在系统树分支上可以看出，蒙古黄芪，达乌里黄芪及直立黄芪分支相比猪屎豆、凹叶野百合要近一些，说明它与沙苑子遗传关系近些，达乌里黄芪和直立黄芪这2个物种在分类支上显示遗传关系也比较近些。通过系统树聚类分析可以将沙苑子与其混伪品直立黄芪、蒙古黄芪、达乌里黄芪、猪屎豆和凹叶野百合有效鉴别开。结果表明ITS序列可以用于鉴别沙苑子与其混伪品，可以成为沙苑子与其混伪品鉴定分析的有效手段，对保证沙苑子药材安全及植物资源合理利用具有重要意义。

3 讨论

通过对购于市场上沙苑子药材的调查结果表明：目前市售沙苑子主流商品为扁茎黄芪的种子，属药典规定品种，但在少数地区仍有混杂使用直立黄芪和紫云英的情况。在河北安国药材市场，成都莲花池及广西玉林药材市场上所收集的24份沙苑子药材样品中，并未出现曾报道过的凹叶野百合、田皂角、直立黄芪和华黄芪等充当沙苑子现象。

由于沙苑子属较细小种子类，据报道沙苑子有多种混伪品，这些混伪品与正品种属比较接近[7-8]，然而运用传统的鉴别方法在药材鉴定方面还未达到理想的快速、准确鉴定的目的。传统的中药材鉴定方法主要基于形态及化学特征，但是二者均受环境和生物生长发育等各种因素的限制，无法满足中药产业现代化发展的需求，DNA 条形码技术具有较强的通用性，已作为药用植物准确鉴定的重要手段，倍受国内外研究者的广泛关注[9-11]。本研究采用DNA条形码技术对市场上采购的沙苑子药材进行鉴别。由于DNA浓度会直接影响PCR扩增效率，因此取样过程中尽可能避免存有杂质，提高PCR扩增的效率。据K-2-P距离遗传分析，正品沙苑子各基源植物种内平均K-2-P距离远小于其与混伪品的种间K-2-P距离。因此ITS序列作为条形码，能将沙苑子药材与混伪品进行很好的区分，从而达到准确鉴定的目的。不仅为沙苑子药用植物正本清源，保证药材安全及植物资源合理利用提供保证，还是对传统鉴别方法的有效补充和科学完善，对保障沙苑子药材用药安全具有重要意义。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：145.

[2] 赵林.沙苑子及其伪品混用品的性状鉴别[J].中国基层医药，2005，12(12)：101.

[3] 崔占虎，李越，袁庆军，等.黄芪与其混伪品的 ITS 序列分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2012，37(24)：3773-3776.

[4] 车建，唐琳，刘彦君，等.ITS 序列鉴定西红花与其易混中药材[J].中国中药杂志，2007，32(8)：668-671.

[5] 刘春生，白根本，阎玉凝.基于核 DNA ITS 序列的细辛药材基源及分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2005，30(5)：329-332.

[6] 许亮，窦德强，王冰，等.牛蒡子及其伪品的 ITS 序列分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2011，36(3)：338-341.

[7] 毕培曦，李慧云，方三曼.沙苑子及其混淆品之鉴别.药物分析杂志，1988，8(4)：210.

[8] 刘笃义.沙苑子与直立黄芪.中药材，1990，13(7)：25.

[9] Pang X，Song J，Zhou U，et al.Applying plat DNA barcodes for Rosaceae species identification[J].Cladistics，2011，27(2)：165.

[10] Song J，Shi L，Li D，et al.Extensive pyrosequencing reveals frequent intra-genomic variations of internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal DNA[J].PLoS ONE，2012，7(8)：e43971.

[11] Gu W，Song J，Cao Y，et al.Application of the ITS2 region for barcoding medicinal plants of Selaginellaceae in Pteridophyta[J].PLoS ONE，2013，8(6)：e67818.

MolecularIdentificationofAstragaluscomplanatusanditsAdulterantsbyITSSequences

ZHANGLe1，ZHUHong1，2，WEIKunhua3，ZHANGChunhong1，LIMinhui1，2*

(1.BaotouMedicalCollege，Baotou，InnerMongolia014060，China；2.InnerMongoliaResearchCenterofCharacteristicMedicinalPlantsCultivationandProtectionEngineeringTechnology，Baotou，InnerMongolia014060，China；3.GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement，GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，Nanning530023，China)

Objective：To explore a new method for identification ofAstragaluscomplanatusfrom its adulterants by using ITS sequences.Methods：10 samples of the differentA.complanatusand 2 samples of original plant，3 samples ofA.dahuricus，4 samples of theA.membranaceusvar.mongholicus，3 samples ofA.adsurgens，1 sample of theCrotalariapallidaandC.retusawere collected.ITS sequence was amplified by PCR and sequenced unidirectionally.The interspecific genetic distances among 6 species ofA.complanatusand its adulterants were calculated，and NJ tree and UPGMA tree were constructed by MEGA 5.Among them，A.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.080 2，and then followed byA.membranaceusvar.mongholicus.A.adsurgensinterspecific was 0.082 4，C.pallidaandC.retusainterspecific was 0.236 2 and 0.229 9，respectively.In addition，A.complanatusintraspecific genetic distance was 0.003 0 computed by MEGA 5.0.Accoding to determination ofA.complanatusadulterants，it showed thatA.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.000 9 andC.pallidawas 0.236 2.Results：ITS sequences were obtained from 24 samples respectively，there wereA.complanatus644-688 bp，A.membranaceusvar.mongholicus664-673 bp，A.adsurgens685-687 bp，A.dahuricus676-688 bp，C.pallida785 bp andC.retusa837 bp.Phylogeny tree reconstruction using NJ and UPGMA analysis based on ITS nucleotide sequences can effectively distinguishA.complanatusfrom adulterants.Conclusion：ITS sequences can be used to identifyA.complanatusfrom its adulterants successfully and is an efficient molecular marker for authentication ofA.complanatusand its adulterants.

Astragaluscomplanatus；ITS sequences；molecular identification

2015-03-25)

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAI28B02)；包头市科技计划项目(2013X2001)；中医药行业科研专项(201407003)

*

李旻辉，教授，研究方向：中药资源、蒙药研究；Tel：(0472)7167739，E-mail：li_minhui@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.7.006