水溶性壳聚糖对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

任彦锋 费瑞 马佳男 刘志强 王霞 费瑜

水溶性壳聚糖对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

任彦锋 费瑞 马佳男 刘志强 王霞 费瑜

目的 探讨水溶性壳聚糖（WSC）对缺血再灌注损伤（IRI）大鼠心肌的保护作用及其机制，为药物防治心肌IRI提供实验依据。方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组、IRI模型组、低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组，每组 12只。其中，IRI模型组和各剂量WSC组大鼠用开胸直视下结扎左冠状动脉前室间支法建立大鼠IRI模型，假手术组大鼠仅分离而不结扎左冠状动脉前室间支。假手术组和IRI模型组给予生理盐水10 ml/kg。低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组分别给予WSC 120 mg/kg、180 mg/kg和240 mg/kg，每日灌胃一次，15 d后处死大鼠。心脏取血，分离血清，用ELSIA法检测血清中SOD和MDA水平。在靠近心尖部1/3处平行于房室沟横行切取新鲜心肌组织块，固定后石蜡包埋。用HE染色法观察心肌组织形态变化。RT-PCR检测心肌组织中UCP2 mRNA表达。结果 光镜下观察，假手术组心肌纤维排列整齐，结构清楚，细胞核染色清晰，心肌间质未见炎性细胞浸润；IRI模型组大鼠心肌纤维紊乱，界线不清，胞浆淡染，核有浓缩或溶解，大量炎性细胞浸润，充血淤血，心肌纤维横纹消失，心肌组织灶性坏死；WSC干预组肌纤维偶有断裂、融解现象，少量心肌细胞颗粒变性、水肿，偶见炎性细胞浸润。与假手术组相比，IRI模型组SOD水平明显下降，而MDA水平和心肌组织中UCP2 mRNA表达均明显升高（P<0.01）；与IRI模型组比较，低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组SOD水平显著提高，MDA水平和心肌组织中UCP2 mRNA表达降低（P<0.05，P<0.01）。结论 WSC可逆转心肌IRI，对IRI大鼠心肌具有保护作用。这种作用可能与对抗IRI时氧化应激反应有关。

水溶性壳聚糖；超氧化物歧化酶；丙二醛；解耦联蛋白2

研究表明，心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）的发病机制与氧化应激有极其密切的关系。药物可通过对抗氧化应激来防止心肌IRI[1-3]。水溶性壳聚糖（water-soluble chitosan，WSC）是甲壳素脱乙酰基的产物，具有抗氧化等作用[4]。但目前有关WSC能否防治心肌IRI的文献报道甚少。为此本研究制作大鼠心肌IRI模型，并用WSC进行干预，旨在探讨WSC对IRI大鼠心肌的作用及机制，为药物防治心肌IRI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性SD大鼠，清洁级，吉林大学白求恩医学院动物中心提供［动物合作证号SCXX（吉）2010-0005］，体重（250±10）g。饲养条件：室温 18℃～25℃，相对湿度 40%～60%，每日正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。所有大鼠实验前在室内给予标准饲料常规饲养2 d，实验前称重，禁食12 h。

UltraCutE超薄切片机（奥地利卫永仪器公司），显微镜（日本JEOL公司），酶标测定仪（日本MODEL550），小动物人工呼吸机（成都泰盟科技有限公司），PCR仪（美国PE公司），凝胶分析仪（杭州天能生物科技有限公司），WSC（青岛海普生物技术有限公司，溶解度为125，脱乙酰度54.73%），大鼠SOD、MDA试剂盒（北京邦定泰克生物技术有限公司），M-MLV反转录试剂盒（北京全式金有限公司），UCP-2和β-actin的基因引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）。大鼠UCP2扩增片段长度为 472 bp（上游引物：5′-GCAGTTCTACACCAAGGGCT-3′；下 游 引 物 ：5′-AGCATG －GTCAGGGCACAGTG-3′），β-actin 扩增片段长度为690 bp（上游引物：5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAG GCC-3′；下游引物：5′-CCACACAGATGACTT GCGCTC AGG-3′）。

1.2 实验方法 按文献报道方法建模：大鼠麻醉，仰卧固定手术台上，连接小动物人工呼吸机和心电图机。剪开心包膜，暴露心脏，左手拇、食指轻压胸廓把心脏挤出，于左心耳下方2 mm处，用10/0号无损伤缝合针穿线，进针深度为1.5～2.0 mm，宽为2～3 mm，适应5 min，在缝合线与左冠状动脉前室间支血管间垫一细小塑料管（直径约1.0 mm），结扎时用活结结扎。同步观察心电图变化，当出现ST段抬高与高耸T波融合呈弓背向上单向曲线，为左室游离壁缺血成功的标志。结扎30 min后剪去胶管使缺血再灌通，再灌通时间为120 min。再通后心电图形表现为缺血图形减轻或出现病理性Q波，当抬高的ST段下降1/2以上，以此图形作为心肌IRI标准，符合标准者即为心肌IRI造模成功并入选实验。假手术组仅分离左冠状动脉前室间支，穿线但不结扎。

将60只大鼠随机分为假手术组、IRI模型组、低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组，每组12只。假手术组和IRI模型组分别给予生理盐水10 ml/kg，低剂量WSC、中剂量WSC和高剂量WSC组分别给予WSC 120 mg/kg、180 mg/kg和240 mg/kg，每日灌胃一次，连续15 d。各组分别于实验结束后处死大鼠，心脏取血，分离血清，用ELSIA法检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。在靠近心尖部1/3处平行于房室沟横行切取新鲜心肌组织块，一部分放入4%多聚甲醛溶液，固定 24 h，石蜡包埋，用HE染色法观察心肌组织形态变化。另一部分心肌组织剪成小块，匀浆后加入1 ml Trizol，在冰上研磨2～3次；加入氯仿200 ml，用力振荡，吸取上清液（内含核酸）；用RT-PCR检测心肌组织中UCP2 mRNA表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件处理。数据以±s表示，多样本均数比较采用方差分析，样本均数间成对比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织形态学观察 光镜下观察，假手术组心肌纤维排列整齐，结构清楚，细胞核染色清晰，心肌间质未见炎性细胞浸润。IRI模型组大鼠心肌纤维紊乱，界线不清，胞浆淡染，核有浓缩或溶解，大量炎性细胞浸润，充血淤血，心肌纤维横纹消失，心肌组织灶性坏死。WSC干预组肌纤维偶有断裂、融解现象，少量心肌细胞颗粒变性、水肿，偶见炎性细胞浸润。见图1。

2.2 WSC对IRI大鼠血清SOD和MDA水平的影响 与假手术组相比，IRI模型组大鼠SOD水平下降，而MDA水平明显升高（P＜0.01）。与IRI模型组比较，低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组大鼠SOD水平显著提高，MDA水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表 1。

表1 各组大鼠血清SOD和MDA水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清SOD和MDA水平比较（±s）

注：SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。与假手术组比较，aP<0.01；与IRI模型组比较，bP<0.05，cP<0.01

组别 SOD（U/L） MDA（nmol/L）假手术组 231.53±10.39 2.95±0.85 IRI模型组 163.21±7.14a5.55±0.26a低剂量 WSC 组 183.16±8.58b3.98±0.26b中剂量 WSC 组 189.64±10.40b3.61±0.25b高剂量 WSC 组 198.52±11.04c3.33±0.23c

2.3 WSC对心肌IRI大鼠心肌组织UCP2 mRNA表达的影响 IRI模型组心肌组织中UCP2 mRNA表达明显高于假手术组（P＜0.01）。低剂量WSC组、中剂量WSC组和高剂量WSC组大鼠心肌组织中UCP2 mRNA表达均明显低于IRI模型组（P＜0.05，P＜0.01）。见图 2。

3 讨论

SOD是机体内清除活性氧簇的一种金属酶，能使生物体内过氧化物转化成过氧化氢和氧，其活性的高低可间接反映体内自由基的浓度。MDA是膜脂质不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产物，是反映氧化损伤的指标。UCP2是一种镶嵌在线粒体内膜上的质子载体蛋白，生理状态下，当机体受到寒冷、ROS和高葡萄糖等刺激后，线粒体UCP2的转录和翻译增加，使线粒体内膜电子流动加快，线粒体膜电势降低，进而发挥其解耦联作用，因此，UCP2又被称为内源性抗氧化蛋白。已有报道IRI时大鼠心肌纤维紊乱，界线不清，胞浆淡染，核有浓缩或溶解，大量炎性细胞浸润，充血淤血，心肌纤维横纹消失，心肌组织灶性坏死，血清 SOD活性明显下降，MDA含量明显升高，心肌UCP2 mRNA和蛋白的表达增加，且与CK活性、MDA含量、SOD活性有一定的相关性[1-3,5]。还有报道UCP2在缺血后表达增多，再灌注1 h后UCP2表达更丰富，UCP2表达增加是心肌对IRI的一种适应性反应，并对IRI心肌有保护作用[6]。本实验结果与文献报道一致，进一步证实氧化应激参与心肌IRI病理过程的结论。

IRI时由于黄嘌呤氧化酶形成增多、中性粒细胞呼吸爆发、线粒体单电子还原增多、儿茶酚胺自氧化增强、细胞内Ca2+超载等因素使活性氧簇增多，过多的活性氧簇对SOD的直接损伤和SOD的大量消耗，使得SOD活性降低，清除活性氧簇能力下降，进而激活内源性抗氧化蛋白-UCP2，UCP2 mRNA表达增加不仅能抑制活性氧簇的产生和细胞炎症反应，还能增强线粒体内钙离子的转导，从而避免细胞内钙的蓄积，防止钙超载引起的细胞凋亡[7]，所以心肌IRI时UCP2 mRNA表达增加对心肌有一定的保护作用。

WSC是壳聚糖脱乙酰反应的产物，具有不形成结晶、流变性和较高的水溶性等特点，因而它独特的生理活性和物化性质更容易得到体现。Hou等[4]的研究发现，WSC能促进成骨细胞功能，如碱性磷酸酶活动、细胞生存能力和矿化，这一过程是通过抗氧化活性进而减少或防止成骨细胞变性来实现的。Safari等[5]发现，氯沙坦可以降低心肌IRI中UCP2 mRNA的表达，可对缺血的心肌起保护作用。周曦等[8]发现，白藜芦醇能抑制UCP2的表达，进而削弱细胞内活性氧簇的生成，从而抑制血管内皮细胞氧化应激损伤。赵东明等[9]发现，阿托伐他汀可以下调心肌梗死后心衰大鼠心肌细胞内UCP2 mRNA的表达水平，从而改善心衰心室重构过程中能量代谢。本实验发现，WSC能改善IRI时造成的心肌组织形态学改变，同时能使SOD水平升高，MDA水平和心肌UCP2 mRNA的表达明显下降，与多数学者报道一致，说明WSC逆转心肌IRI，对IRI大鼠心肌具有保护作用。这种作用可能与对抗IRI时氧化应激反应有关。

WSC的分子结构含有2个羟基和2个氨基，它们能与自由基结合[10]，使活性氧簇下降，SOD的功能得以恢复，当氧化应激消除或者减轻后，UCP2 mRNA的表达自然会下降。线粒体主要功能是给机体提供能量，当三羧循环产生的还原当量沿电子传递时，释放出的能量可将H+从线粒体基质转移到内膜的胞液面，形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度。当质子从线粒体胞液面顺梯度到基质时，其中蕴含的能量能将ADP与磷酸结合生成ATP。若H+进入线粒体内膜，不能参与ATP合成，则能量以热量的形式散失。心肌是高能量组织，其工作需要大量ATP，而UCP2表达下降，质子漏得到抑制，使ΔuH+升高，有利于ATP的合成，防止细胞内酸中毒，避免心肌细胞凋亡。另外，UCP2表达下降抑制质子漏，电子沿呼吸链传递也受到抑制，结果使活性氧簇生成增加。由此可见，UCP2的表达本身就是一把“双刃剑”，但给心肌提供能量要比活性氧簇生成增加重要。这是因为给心肌提供能量能够维持整个细胞和组织器官的功能，该过程生成的活性氧簇在生理情况下可由SOD清除，在病理情况下UCP2的表达仅仅是个代偿机制，只有UCP2表达下降才能恢复机体正常生理功能。因此，UCP2 mRNA的表达下降也是对心肌的一种保护。

图1 大鼠心肌组织形态学变化（10×40）

图2 WSC对心肌IRI大鼠心肌组织中UCP2 mRNA表达的影响

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Protective effect of water-soluble chitosan on rat myocardial ischemia reperfusion injury

REN Yan-feng＊，FEI Rui，MA Jia-nan，et al.＊Department of Cardiology，Central Hospital of Xinxiang，Xinxiang 453000，China

FEI Yu，E-mail：feiyusir@163.com

Objective To investigate the protective effects of WSC on myocardial IRI in rats and its mechanism，to provide experimental basis for drug prevention and treatment of myocardial IRI.Methods 60 SD rats were randomly divided into sham operation group，IRI model group，low dose WSC group，medium dose WSC group，high dose of WSC group，12 rats in each group.Among them，the IRI model group and each dose group WSC rats by left thoracotomy anterior interventricular branch of left coronary artery was ligated to establish IRI rat model，the rats in the sham operation group only isolated without ligation of the left anterior descending coronary artery.Sham operation group and IRI model group were given normal saline 10 ml/kg，low dose WSC group，middle dose of WSC group and high WSC group were given 120 mg/kg，180 mg/kg and 240 mg/kg，by gavage once a day，the rats were sacrificed after 15 d，heart blood，serum separation，ELSIA was used to detect the serum SOD and MDA levels.Near the apex of 1/3 parallel to the atrioventricular groove of transverse cut fresh myocardial tissue after fixation，paraffin embedding.The morphological changes of myocardial tissue were observed with HE staining.The expression of UCP2 mRNA in detecting myocardial tissue was observed with RT-PCR.Results Under the light microscope，in sham operation group，the myocardial fibers arranged orderly，clear structure，clear nuclear staining，and myocardial interstitial has no inflammatory cell infiltration.In IRI model group rats myocardial fibers showed disorder，boundary was not clear，and lightly stained cytoplasm，nucleus condensed or dissolved，a large number of inflammatory cells infiltration，hyperemia，congestion，myocardial fiber stripes disappear，myocardial tissue necrosis were observed；In intervention group WSC showed muscle fiber melt fracture phenomenon of myocardial cells，granular degeneration，edema，inflammatory cell infiltration and occasional.Compared with the sham operation group，IRI model group，SOD levels were significantly decreased，while the level of MDA and UCP2 mRNA expression in myocardial tissue were significantly increased（P<0.01），compared with the IRI model group，low dose WSC group，medium dose WSC group and high dose WSC group could significantly increase the level of SOD，reduce the expression of UCP2 mRNA and the level of MDA myocardial tissues（P<0.05，P<0.01）.Conclusion WSC can attenuate myocardial IRI，has a protective effect on myocardium of IRI rats.This effect may be related to the oxidative stress reaction against IRI.

Water-soluble chitosan；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Uncoupling protein 2

吉林省自然科学基金资助（项目编号：201215058）

453000 河南省新乡市，新乡市中心医院心内科（任彦锋、刘志强、王霞）；

吉林大学基础医学院吉林大学临床医学院（费瑞、马佳男）；吉林大学第二医院心内科（费瑜）

费瑜，E-mail：feiyusir＠163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.11.019

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）11-1037-05

2015-07-16）