核壳液相色谱-蒸发光散射检测法直接检测20种氨基酸*

陈建秋王玉红李鹏李静,阎超,**(.上海交通大学药学院 上海 0040；．上海通微分析技术有限公司 上海 003)

核壳液相色谱-蒸发光散射检测法直接检测20种氨基酸*

陈建秋1王玉红2李鹏2李静1,2阎超1,2**
(1.上海交通大学药学院 上海 200240；2．上海通微分析技术有限公司 上海 201203)

目的：应用蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector, ELSD）、“HALO”核-壳型新型填料液相色谱柱，建立一种高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）直接测定20种未衍生氨基酸的分析方法，并将其用于复方氨基酸注射液中氨基酸含量的测定。方法：采用核-壳型HALO色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm C18），以甲醇-九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水为流动相进行梯度洗脱，流速0.5 ml/min，ELSD飘移管温度40 ℃，载气流速3.0 L/min，对20种基本氨基酸进行分离检测。结果：氨基酸的质量浓度在0.01～1.0 mg/ml范围内，其峰面积的对数值与进样质量的对数值呈良好的线性关系；氨基酸的检出限介于20～50 ng之间，样品加标回收率为89.0%～111.2%。结论：该方法操作简便快速、准确可靠，溶剂消耗少，为药品、食品、饲料及化工生产等领域混合氨基酸样品的直接检测提供了参考。

反相高效液相色谱 蒸发光散射检测器 核壳型填料 未衍生氨基酸

氨基酸是生命体基本物质之一，也是常见的食品添加剂和药物制剂成分。由于氨基酸具有高极性、低挥发性、大部分无强发色基团的特性，其分离和检测都较为困难，而目前常规使用的氨基酸分离检测方法是柱后在线衍生“茚三酮”法，即经典氨基酸分析仪法，其存在仪器昂贵、运行费用高、衍生物不稳定、反应条件冲突、操作时间长等诸多问题[1-4]。

本研究采用国产HPLC-ELSD平台及核壳型填料色谱柱[5-8]，在未衍生情况下将20种氨基酸在30 min内达到基本基线分离[9-10]。

1 实验部分

1.1 仪器，试剂与材料

EasySepTM-1020高效液相色谱仪（上海通微分析技术有限公司）；UM-5000蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；KQ2200B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；FA1004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）

氨基酸对照品：牛磺酸（taurine）、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys-Cys)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)，纯度均大于99.0%，均购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸(TFA)(HPLC级，美国天地公司)；七氟丁酸和九氟戊酸(HPLC级，J&K chemical 公司）；甲醇(HPLC级，国药集团上海化学试剂有限公司)；水为二次重蒸馏水；其他试剂均为分析纯；复方氨基酸注射液（15AA）(批号：1110281-1，江苏四环生物股份有限公司); HALO C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm）（上海通微分析技术有限公司）。

1.2 溶液制备

对照品储备液：分别称取20种氨基酸对照品适量，置于同一量瓶中，加0.2 mol·L-1盐酸溶液溶解配制成各氨基酸浓度均约为1.0 mg·ml-1的混合溶液，用0.22 mm滤膜过滤备用。

供试品溶液：将复方氨基酸注射液（250 ml∶20 g（总氨基酸））以二次重蒸馏水稀释50倍，用0.22 mm滤膜过滤备用[11-12]。

1.3 色谱条件

流动相：A相为九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水(1∶5∶0.6∶1000，V/V/V/V)；B相为甲醇；梯度洗脱程序：0～8 min，0%B；8～13 min，0%B～20%B；13～23 min，20%B～40%B；23～25 min，40%B～60%B，保持至5.5 min。流速0.5 ml·min-1。漂移管温度40 ℃；载气流速3.0 L·min-1；进样体积10 ml；柱温25 ℃。

2 结果

2.1 对照氨基酸溶液的分离

取对照品储备液适量，稀释成0.05 mg·ml-1混合溶液，以10 ml定量环进样，20种氨基酸的分离结果如图1所示。通过色谱图，计算各组分的理论塔板数和分离度，其最小值分别为3 167（按taurine峰计)和1.13（Gly峰与Ser峰)，在该色谱条件下，20种氨基酸峰能在30 min内基本达到基线分离。

图1 20种氨基酸对照品混合液的HPLC-ELSD色谱图

2.2 线性关系和检出限

分别取20种氨基酸质量浓度均约为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mg·ml-1的对照品混合溶液，在上述条件下分析，以各氨基酸样品浓度（mg·ml-1）的对数X为横坐标，以各氨基酸峰面积的对数Y为纵坐标进行线性回归，各氨基酸的线性回归方程见表l。以0.01 mg·ml-1对照品混合溶液进样，并读取各氨基酸的对应峰高，逐步稀释混合溶液，当各氨基酸信噪比约为3时，计算得到各氨基酸组分的检出限介于20～50 ng之间，其中丝氨酸的检出限最高，为50 ng（折合质量浓度为0.005 mg·ml-1）[13]。

表l 20种氨基酸线性方程

2.3 方法的精密度

取0.05 mg•ml-1混合对照品溶液，在上述色谱条件下进样10 ml，重复进样6次，测定保留时间和峰面积。各组分保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.04%～0.6%，峰面积的RSD为1.7%～2.8%。

2.4 样品回收率

精密量取3份复方氨基酸注射液样品分别置于容量瓶中，加入一定量的氨基酸对照品溶解后，按供试品溶液制备方法制备后测定（图2）。因样品中Cys含量低于该色谱条件下的检测限，故仅检测出了14种氨基酸。样品中14种氨基酸回收率均在89.0%～111.2%之间，RSD为1.9%～9.7%。

2.5 样品分析

配制3份供试品溶液进样分析，结果见表2。

图2 复方氨基酸注射液的HPLC-ELSD色谱图

表2 复方氨基酸注射液检测结果

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

本研究采用的色谱柱为新型核壳型填料色谱柱（HALO色谱柱），其整体粒径大小为2.7 mm，其中多孔外壳大小为0.5 mm。该色谱柱具有亚2微米色谱柱的超高柱效，可在常规高效液相色谱仪上进行复杂混合物的快速分离，实现近似UHPLC的性能[14]，但操作背压却不高于400 bar（4×107Pa），且易于在不同仪器上进行方法转移。其原理是因为核壳结构降低了涡流扩散和提供了更快的传质过程，导致色谱峰扩散和柱背压较低。核壳型颗粒并不完全多孔，应用Fused-core处理技术与纳米结构技术的结合，在坚实的硅胶核心上生成了一个既坚固又均匀的多孔外壳，且几乎没有硅醇活性。此外该色谱柱所用的筛板孔径（2 mm）要远远大于UHPLC（0.5 mm），解决了UPLC柱入口筛板的堵塞问题[15-16]。运用该色谱柱，在30 min内能达到样品的基线分离，降低了分析成本，提高了样品检测速度。

3.2 流动相的选择

本研究选择离子对试剂作为流动相结合梯度洗脱进行氨基酸的分离。实验中分别选择甲醇和乙腈作为有机相进行梯度洗脱，发现同一条件下，乙腈对极性弱的氨基酸洗脱较强，造成保留时间提前，分离度明显变差，综合考虑，选择甲醇作为有机相进行梯度洗脱。另外，我们首先选择七氟丁酸-三氟乙酸-水进行流动相筛选。当逐渐增加七氟丁酸的浓度（0.3%、0.4%、0.5%），甘氨酸和丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸分离度略增加，但仍没有达到基线分离；同时考察了九氟戊酸离子对试剂对氨基酸分离度的影响，其对苏氨酸和丙氨酸的分离有了很大的提高。本研究创造性地将九氟戊酸和七氟戊酸按一定比例结合，解决了亲水性氨基酸分离度不好的问题。另对三氟乙酸的浓度对氨基酸分离的影响也进行了考察，发现随着三氟乙酸浓度的降低，原先较难分离的甘氨酸和丝氨酸的分离度明显增加，但这种变化对其他氨基酸的分离度也有一定影响，综合考虑下，最终选择三氟乙酸的浓度为0.05%。

3.3 流速对分离度的影响

分别调整流速为0.5、0.6、0.8和1.0 ml·min-1，考察各氨基酸的分离度，结果流速越高，最难分离的甘氨酸和丝氨酸的分离度越差，且梯度洗脱时柱压达到最大值。考虑实际应用，我们选择流速为0.5 ml·min-1。

3.4 色谱柱柱温的选择

分别在室温（25 ℃）和45 ℃条件下进行液相分离，发现温度越高，氨基酸的保留时间越短，甘氨酸和丝氨酸的分离度越差。原因是温度升高，减少了离子对对色谱柱硅胶的相互作用，使保留减弱。因此，我们选择室温条件下进行分离。

3.5 蒸发光散射检测器参数的选择

实验中使用的蒸发光散射检测器是低温型ELSD检测器，可在较低温度下实现流动相的完全蒸发，有效降低溶剂形成的背景噪声，同时避免了仪器在高温下可能产生的信号噪声干扰，提高了样品检测灵敏度。分别设定漂移管温度为30、35、40、45和50 ℃，以各氨基酸的信噪比为考察对象，结果显示漂移管温度在30～50 ℃无明显差别。考虑到漂移管温度低于溶剂蒸发温度时，流动相无法充分挥发，造成基线背景水平升高；而漂移管温度过高时，可能会带来较大的噪声，且检测器温度应保证高于实验室温度以便温度的调节控制，故本实验选用了40 ℃作为漂移管温度。

保持漂移管温度为40 ℃不变，对载气流量（2.0、2.5、3.0、3.5 和4 L·min-1）进行考察，结果显示在低载气流量下样品信号响应较高，但甘氨酸和丝氨酸的分离度有所降低，分析其原因，应该是在低气体流速条件下，样品色谱峰的展宽造成的；最终选用载气流量为3.0 L·min-1。

4 总结

本文实验基于核壳型填料色谱柱，建立了一种反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法分离检测未衍生氨基酸，可在30 min内完成20种未衍生氨基酸的分离测定，且基本达到基线分离，同时，选择色谱流速为0.5 ml·min-1，在达到氨基酸分离的同时，也减少了流动相的使用量，明显降低了检测成本，也减少了环境污染。该方法简便快速、准确可靠，适用于氨基酸注射液中氨基酸含量的直接测定，同时该方法可开发为饲料中混合氨基酸样品的检验。所以，其对食品安全管理、药物质量控制和相关生产工业的工艺改良、质量控制都有积极的作用。

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Simultaneous determination of 20 amino acids by core-shell ODS column HPLC with evaporative light-scattering detection*

CHEN Jianqiu1, WANG Yuhong2, LI Peng2, LI Jing1,2, YAN Chao1,2**
(1. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Unimicro (Shanghai) Technologies Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

Objective: An analytical method for the determination of 20 underivatized amino acids was established using HPLC with HALO column coupled with an evaporative light-scattering detector (ELSD). Methods: The HALO column was packed with a core-shell C18stationary phase (4.6 mm×150 mm, 2.7 mm). A solvent gradient elution was performed with nonafluoropentanoic acid-heptafluorobutyric acid containing trifluoroacetic acid as mobile phase A and methanol as mobile phase B. The temperature of the drift tube in ELSD was set at 40℃ and the flow rate of carrier gas was 3.0 L/min. Results: There was a good linear relationship between the logarithm of the peak area and logarithm of the mass of each separated amino acid. The limits of detection for the underivatized amino acids were from 20 ng to 50 ng. The average recoveries of the 20 amino acids were between 89.0%and 111.2%. Conclusion: This method is simple, rapid and accurate for the determination of underivatized amino acids and can be widely used for the determination of underivatized amino acids in pharmaceutical, food, animal feeds and chemical industries.

reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC); evaporative light-scatting detection(ELSD); core-shell stationary phase column; underivatized amino acids

R927.2; O657

A

1006-1533(2015)11-0075-05

科技部中小企业创新基金-核壳型色谱填料及色谱柱的产业化（12C26213202212）

**

阎超，博士生导师，教授，主要从事微分离分析和电色谱分离领域的研究。E-mail：chaoyan@ unimicrotech.com

2015-04-08）