p75NTR介导神经细胞凋亡对老龄鼠学习记忆的影响及补肾方药的作用

康湘萍 梁 超 金国琴 张学礼 龚张斌 夏花英

(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203)

伴随衰老，机体会出现一系列生理功能下降或紊乱的表现，尤其是脑结构和功能的改变，后者会直接导致老年人认知能力进行性损害，影响老年人的活动能力及生活质量，给家庭、社会带来沉重的负担〔1～3〕。中医认为肾乃先天之根，封藏之本;《灵枢·经脉》云:“人之情与志，皆藏于肾”;故历年来补肾益精填髓被中医临床用作改善学习记忆退化的重要治则。本研究以中医衰老肾虚理论为指导，从sortilin脑源性神经生长因子前体(proBDNF)-p75NTR介导的神经细胞凋亡入手，进一步探究老年学习记忆能力减退的分子机制，同时观察经典补肾方药左归丸及其君药熟地黄对该途径的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物 左归丸组成:熟地黄20 g、山药10 g、菟丝子10 g、枸杞子 10 g、山茱萸 10 g、牛膝 7.5 g、龟板胶 10 g、鹿角胶10 g，上述中药均购自上海康桥中药饮片有限公司，汤药常规方法煎煮，最终浓缩为含生药1 g/ml的煎液，-20℃保存;熟地黄水煎后过滤，浓缩为每1 ml药液含2 g生药的提取药液，-20℃保存，临用前饮用水稀释后灌胃使用。

1.2 动物造模及分组 雄性SD大鼠，SPF级，体重(250±30)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(沪)2009-0069。大鼠称重后随机分为五组:青年对照组、衰老模型组、衰老左归组、衰老熟地大剂量组(简称衰老熟大组)及衰老熟地小剂量组(简称衰老熟小组)。除青年对照组外，其余各组大鼠均腹腔注射D-半乳糖生理盐水500 mg/kg，连续造模56 d〔4〕，青年对照组腹腔注射等量生理盐水;衰老左归组灌服左归丸药液，剂量相当于临床成人每kg体重剂量的7倍〔5〕，衰老熟大组灌服熟地黄药液8 g/kg体重，衰老熟小组灌服熟地黄药液4g/kg体重，青年对照组和衰老模型组灌服蒸馏水，每只大鼠的灌胃体积均为4 ml，连续56 d〔6〕。

1.3 试剂与仪器 D-半乳糖(上海国药集团化学试剂有限公司)、化学发光试剂盒(ECL)(Pierce公司)、PVDF膜(Milipore公司)、proBDNF抗体、sortilin抗体(Abcam公司)，p75NTR抗体、caspase-3抗体、bcl-2抗体、bax抗体、GAPDH抗体(Cell Signaling公司)，超薄切片机(Leica Ultracut R)，透射电镜(型号:Philips Tecnai-12 Biotwin)，蛋白电泳仪、电泳槽、转移槽(Bio-Rad公司)及凝胶成像分析系统(美国Protein Simple公司，FCM型)。

1.4 空间学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫法，平台设于迷宫西南象限正中，水面高出平台1.5 cm，水温19℃ ～20℃，大鼠连续训练5 d，2次/d，分别从正北、正东两个起始点投放，设定最长游动时限为70 s，电脑自动计时，记录大鼠找到平台所需要的时间，即潜伏期。如大鼠70 s内未能找到平台，潜伏期计为70 s。记录各组大鼠每天两次潜伏期(s)，取均值。

1.5 透射电镜观察海马神经细胞凋亡情况 海马组织分离后切成1 mm×1 mm×3 mm的长条小块，2.5%戊二醛固定，pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，再用1%锇酸固定，梯度酒精、丙酮脱水，618树脂浸透包埋，超薄切片机切片，3%醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察、拍片。

1.6 Western印迹法检测海马组织proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达 分别提取各组大鼠海马蛋白，双缩脲法定量蛋白并根据测定结果稀释处理蛋白。SDSPAGE电泳，上样量为40 μg蛋白/孔，电泳结束后，300 mA恒流转膜60 min，然后37℃、5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜(所有一抗的稀释比例均参照抗体说明书)。次日，0.1 mmol/L PBST(pH7.4)洗膜后加入二抗(1∶10000 倍稀释)，37℃孵育45 min，PBST洗膜后ECL显色检测结果，并求积分密度值(IOD)。

1.7 统计学处理 采用SPSS17.0软件，所有数据均以±s表示，组间比较采用t检验、重复测量数据的方差分析〔7〕。

2 结果

2.1 Morris水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力 随着训练天数增加，各组大鼠潜伏期(s)呈逐渐缩短趋势。从训练的第4天起，衰老模型组潜伏期较青年对照组明显延长(P＜0.05)，衰老熟大组较衰老模型组潜伏期显著缩短(P＜0.05);从游泳的轨迹上看，青年大鼠多以直线式和趋向式为主，而衰老模型大鼠多以边缘式为主，见表1，图1。

2.2 电镜检测各组大鼠海马神经细胞凋亡情况 青年对照组大鼠海马神经元形态及染色质正常，核较小，可见线粒体及内质网;衰老模型组大鼠海马神经元体积较小，着色深，周边线粒体可见明显肿胀，核仁完整，核仁有固缩现象;衰老左归组、衰老熟大组及衰老熟小组大鼠海马神经细胞体积略有缩小，细胞形态较完整，周边线粒体略有肿胀，核仁完整，略有固缩，见图2。

表1 左归丸及熟地对各组大鼠潜伏期的影响(±s，n=10，s)

表1 左归丸及熟地对各组大鼠潜伏期的影响(±s，n=10，s)

与青年对照组比较:1)P＜0.05;与衰老模型组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年对照组 63.9±4.157.3±5.3855.6±6.139.8±3.725.4±2.2衰老模型组 70.0±0.066.9±3.163.6±3.361.1±3.71)54.8±3.91)衰老左归组 63.1±4.764.0±4.463.8±3.156.0±3.747.1±4.4衰老熟大组 67.1±2.967.8±1.564.6±3.659.3±3.851.6±4.6衰老熟小组 68.7±1.366.0±2.258.3±5.343.5±3.02)34.1±2.32)

图1 各组大鼠典型运动轨迹图

图2 透射电镜观察各组大鼠海马神经细胞凋亡情况

2.3 Western印迹法检测海马组织proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达 如表2、图3所示，与青年对照组比较，衰老模型大鼠海马proBDNF、caspase-3、bax表达明显升高，bcl-2表达明显降低(P＜0.05)，p75NTR和sortilin表达有升高的趋势;与衰老模型组比较，左归丸、熟地均能不同程度地降低衰老模型大鼠海马proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表达，提高bcl-2蛋白表达。

表2 左归丸及熟地对各组大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达的影响(±s，n=7)

表2 左归丸及熟地对各组大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达的影响(±s，n=7)

proBDNF p75NTR sortilin caspase-3 bcl-2 bax青年对照组 0.393±0.0360.353±0.0650.388±0.0490.121±组别0.0280.638±0.0420.319±0.049衰老模型组 0.676±0.0481) 0.571±0.0970.747±0.0900.700±0.0491) 0.169±0.0301) 0.727±0.0531)衰老左归组 0.520±0.0282) 0.502±0.0760.645±0.0930.349±0.0602) 0.390±0.0412) 0.520±0.0542)衰老熟大组 0.493±0.0492) 0.468±0.0830.605±0.0810.362±0.0602) 0.318±0.0362) 0.617±0.047衰老熟小组 0.448±0.0452) 0.462±0.0790.578±0.0590.257±0.0202) 0.370±0.0452) 0.495±0.0462)

图3 各组大鼠海马proBNP、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2、bax 蛋白表达

3 讨论

D-半乳糖致衰老是根据衰老的代谢学说建立起来的造模方法，具有造模时间短、操作简便、重复性好等优点，可表现出和自然衰老大鼠相似的衰老体征〔8〕，尤其是学习和记忆保持能力的降低〔9〕。

BDNF属于神经营养素(NT)蛋白家族中的一员，是神经元与神经胶质细胞的重要营养因子，被认为是学习记忆过程中的关键蛋白之一〔10，11〕。与其他神经营养因子一样，BDNF由其前体物质proBDNF裂解而成。在很长一段时间内，proBDNF被认为只是单纯的蛋白前体分子而不具有生物学活性，直到1997年，Dicou等〔12〕首次报道proBDNF与成熟的BDNF同样具有生物学活性;后续大量研究也证实〔13，14〕，proBDNF 可能有着和BDNF相反的生物学功能，能够降低老龄大鼠的学习记忆能力。神经营养素有两种受体即低亲和力受体p75NTR和高亲和力受体Trk，BDNF通过其高亲和力受体TrkB的介导作用，最终可以影响海马神经元突触可塑性和学习记忆功能，在LTP的形成中具有非常重要的作用〔15〕;而proBDNF则与p75NTR以高亲和力结合，激活p75NTR介导的细胞凋亡，并且这种结合需要有一种特定的膜蛋白，这种膜蛋白就是sortilin，它是一个相对分子量为95 kD的Ⅰ型膜糖蛋白，在神经系统和肌肉中广泛表达。研究表明〔14，16〕，sortilin是与 proBDNF 及 p75NTR 结合形成三聚体从而启动caspase依赖性神经细胞凋亡，最终导致神经元退行性疾病的发生。

本研究结果提示sortilin-proBDNF-p75NTR启动的细胞凋亡可能是导致增龄性学习记忆能力减退的重要原因之一。

老年性学习记忆减退属于中医“健忘”的范畴，其病位在脑而本于肾，“肾虚、髓海不足”是学习记忆减退的主要病机，故治疗当以补肾填精益髓为主。左归丸为明代张景岳所创，是补肾填精的名方，方中重用熟地黄滋肾益精，以填真阴，为君药;有研究表明〔17〕，熟地黄能改善D-半乳糖致衰老大鼠学习记忆能力，提高脑组织的抗氧化能力，延缓脑细胞衰老的进程。本研究的结果也表明，左归丸与熟地黄能不同程度地改善神经细胞凋亡，下调衰老大鼠海马 proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表达，上调bcl-2蛋白表达，从而改善衰老大鼠的学习记忆能力，延缓衰老。

1 李会杰，左西年.认知与脑老化〔J〕.中国现代神经疾病杂志，2014;14(3):170-5.

2 Bishop NA，Lu T，Yankner BA.Neural mechanisms of ageing and cognitive decline〔J〕.Nature，2010;464(7283):529-35.

3 Mitchell AJ，Kemp S，Leon B，et al.The influence of cognitive impairment on health-related quality of life in neurological disease〔J〕.Aca Neuropsychiatr，2010;22(1):2-13.

4 康湘萍，金国琴，韩志芬，等.益气聪明汤及其加减方对D-半乳糖致衰老模型大鼠cAMP/PKA/CREB信号转导通路的影响〔J〕.上海中医药大学学报，2010;24(3):60-4.

5 康湘萍，金国琴，梁 超，等.补肾方药对老年大鼠学习记忆相关信号分子 mRNA表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(9):2064-7.

6 李龙宣，赵 斌，许志恩，等.熟地黄抑制阿尔茨海默病样大鼠海马神经元凋亡的作用〔J〕.中华神经医学杂志，2006;5(1):10-3.

7 邱 宏，金国琴，金如峰，等.水迷宫重复测量数据的方差分析及其在SPSS中的实现〔J〕.中西医结合学报，2007;5(1):101-5.

8 李树梅，卢胜明，康 峰，等.衰老动物模型的研究进展及应用〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(19):3869-72.

9 邵 丽，葛许华，耿德勤，等.亚急性衰老动物模型的建立及机制〔J〕.中风与神经疾病杂志，2012;29(6):499-501.

10 Kullmann DM，Lamsa KP.Long-term synaptic plasticity in hippocampal interneurons〔J〕.Nat Rev Neurosci，2007;8(9):687-99.

11 Carla C，Riccardo B，Kerrie LT.A simple role for BDNF in learning and memory〔J〕.Front Mol Neurosci，2010;3(1):1-14.

12 Dicou E，Pflug B，Magazin M，et al.Two peptides derived from the nervegrowth factor precursor are biologically active〔J〕.Cell Biol，1997;136(2):389-98.

13 Shawn J，Yang F，Ji YY，et al.ProBDNF and mature BDNF as punishment and reward signals for synapse elimination at mouse neuromuscular junctions〔J〕.J Neurosci，2013;33(24):9957-62.

14 Taylor AR，Gifondorwa DJ，Robinson MB，et al.Motoneuron programmed cell death in response to proBDNF〔J〕.Dev Neurobiol，2012;72(5):699-712.

15 Mocchett II，Brown M.Targeting neurotrophin receptors in the central nervous system〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets，2008;7(1):71-82.

16 Dan F，Taeho K，Enginözka N，et al.Molecular and structural insight into proNGF engagement of p75NTR and sortilin〔J〕.J Mol Biol，2010;396(4):967-84.

17 安红梅，史云峰，胡 兵，等.熟地黄对D-半乳糖衰老模型大鼠脑衰老的作用研究〔J〕.中药药理与临床，2008;24(3):59-60.