辛伐他汀联合依折麦布对急性心肌梗死患者T淋巴细胞亚群比例影响的研究

魏红 王敬萍 柴晓红 王日军 杨晋静 庞工力 王宁 王婧

辛伐他汀联合依折麦布对急性心肌梗死患者T淋巴细胞亚群比例影响的研究

魏红 王敬萍 柴晓红 王日军 杨晋静 庞工力 王宁 王婧

作者单位：030001 山西省太原市，山西医科大学第一临床医学院

目的 比较辛伐他汀联合依折麦布和单用辛伐他汀治疗对急性心肌梗死（AMI）患者外周血CD4+CD28-调节T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞比例的影响，探讨依折麦布联合辛伐他汀在AMI治疗中的作用。方法 选择2014年4～11月在山西省心血管病医院重症监护室住院并治疗的AMI患者40例，随机分为对照组及试验组。对照组（20例）给予辛伐他汀40 mg每晚1次；试验组（20例）给予辛伐他汀40 mg每晚1次，联合依折麦布10 mg每日1次。所有患者分别于治疗前及治疗后15 d通过流式细胞仪检测外周血CD4+CD28-T细胞及CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞比例。结果 对照组治疗前CD4+CD28-T细胞占CD4+T细胞百分比为（95.41±5.24）%，与治疗15 d后的（95.07±2.24）%比较未见统计学差异（P＞0.05）。试验组治疗前CD4+CD28-T细胞占CD4+T细胞百分比为（93.55±6.43）%，较治疗15 d后的（91.72±4.98）%下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组治疗前CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞百分比为（0.81±0.79）%，与治疗15 d的（0.86±0.86）%比较未见统计学差异（P＞0.05）。试验组治疗前CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞百分比为（0.85±0.87）%，与治疗15 d后的（0.62±0.57）%比较未见统计学差异（P＞0.05）。结论 AMI患者应用辛伐他汀联合依折麦布治疗可下调外周血CD4+CD28-T淋巴细胞，而对CD4+CD25+FoxP3+T淋巴细胞无明显影响。

急性心肌梗死； 动脉粥样硬化； CD4+CD28-调节性T细胞； CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞； 流式细胞术

cell； CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cell； Flow cytometry

急性心肌梗死（AMI）的主要病理基础为不稳定的冠状动脉粥样硬化（AS）斑块破裂、出血及继发性血栓形成，导致冠状动脉管腔完全或不完全堵塞。AS是慢性炎症性疾病。研究发现，AS损伤处聚集的T淋巴细胞主要是CD4+CD28-T细胞[1]，该细胞亚群具有高效的促炎特征，而CD4+CD25+调节T细胞亚群可通过直接细胞接触抑制或分泌调节性细胞因子白介素-10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）抑制炎症反应[2]。依折麦布是一种选择性的小肠胆固醇吸收抑制剂，且和他汀类药物一样具有多效应，如抗炎[3]、保护内皮细胞功能、抑制炎症因子和单核细胞迁移等作用。本研究比较辛伐他汀联合依折麦布和单用辛伐他汀治疗，对AMI患者外周血CD4+CD28-调节T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞比例的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2014年4～11月在山西省心血管病医院重症监护室住院确诊的AMI患者40例，其中男性27例、女性13例，年龄35～75（57.2± 14.8）岁。入选标准：AMI诊断按照世界卫生组织冠心病诊断标准，有典型的缺血性胸痛症状持续时间≥30 min，胸痛发作时伴随心肌缺血的心电图改变，且有心肌损伤标志物（心肌酶及肌钙蛋白I升高）。排除标准：慢性病毒性肝炎，脂肪肝，肝功能异常（丙氨酸转氨酶大于1.5倍正常上限），肾功能异常（血肌酐大于2.0 mg/dl），甲状腺疾病，心功能级Ⅲ或Ⅳ级，自身免疫性疾病，肿瘤及正在接受免疫调节剂及他汀治疗等。将符合入选标准的患者随机分为对照组（20例）和试验组（20例）。对照组给予辛伐他汀40 mg，每晚1次，口服；试验组给予辛伐他汀40 mg，每晚1次，联合依折麦布10 mg，每日1次，口服。以上治疗均经患者同意。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂与仪器 荧光素耦联抗体（美国BD公司产品）PE-抗CD28，APC-抗CD25，PE-抗Foxp3，FITC-抗CD4；流式细胞仪FACSCalibur（美国Becton Dickinson公司）；人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限责任公司）

1.2.2 资料收集 全部受试者于入院第2天和第15天清晨空腹、平卧状态下采集肘静脉血2 ml，用EDTA抗凝，通过流式细胞仪检测外周血CD4+CD28-调节T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞。

1.2.3 试验方法 依据密度梯度离心法原理，将淋巴细胞分离液2 ml加入试管中，并将2 ml抗凝全血与PBS液1∶1进行混匀后缓慢加入到分离液上，用1500 r/min离心15 min，收集第2层淋巴细胞，用PBS液洗涤3次，调整细胞数至1×106/ml后，分别检测CD4+CD28-调节性 T细胞及 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。

1.2.3.1 CD4+CD28-调节性T细胞检测 检测管加入FITC-抗CD4标记的抗人 CD4 20μl，PE标记的抗人CD28 20μl，检测管加入100μl Buffer液避光孵育20 min。洗涤细胞后，用250μl缓冲液重悬细胞后立即上机分析。

1.2.3.2 CD4+CD25+Foxp+调节性T细胞的检测 检测管加入FITC-抗CD4标记的抗人CD4 20μl，APC标记的抗人CD25 20μl，于检测管加入100μl Buffer液避光孵育20 min。洗涤细胞后固定细胞，加入2ml人Foxp3 Buffer A，混匀后避光孵育10min。于细胞破膜后加入0.5 ml人Foxp3 Buffer C工作液，混匀后避光孵育30 min。洗涤细胞后于检测管加入PE标记的抗人Foxp3 20μl，避光孵育30min。洗涤细胞后，用250μl缓冲液重悬细胞后立即上机分析。

1.3 统计学方法 所有资料应用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料结果以±s表示，符合正态分布的计量资料采用t检验，不符合正态分布的计量资料采用秩和检验；计数资料比较使用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 对照组及试验组比较，年龄、性别、吸烟，合并高血压、糖尿病比例，血液生化检测等基线资料比较未见统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 两组临床基线资料比较（±s）

表1 两组临床基线资料比较（±s）

注：TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇

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2.2 两组治疗前、后血脂比较 对照组治疗15 d后TC及LDL-C均较治疗前下降（P＜0.05）；试验组治疗后总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇明显下降（P＜0.01）。见表2。

表2 治疗后两组血脂比较（±s）

表2 治疗后两组血脂比较（±s）

注：TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇

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2.3 两组治疗前、后CD4+CD28-T细胞占CD4+T细胞百分比比较 对照组治疗后15 d，CD4+CD28-T细胞占CD4+T细胞百分比为（95.07±2.24）%，与治疗前的（95.41±5.24）%比较未见统计学差异（P＞0.05）；试验组治疗后15 d，CD4+CD28-T细胞占CD4+T细胞百分比为（91.72±4.98）%，较治疗前的（93.55±6.43）%下降（P＜0.05）。见表3、图1。

2.4 两组治疗前、后CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞百分比比较 对照组治疗后15 d，CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞百分比为（0.86± 0.86）%，与治疗前的（0.81±0.79）%比较未见统计学差异（P＞0.05）；试验组治疗后15 d，CD4+CD25+FoxP3+T细胞占 CD4+T细胞百分比为（0.85± 0.87）%，与治疗前的（0.81±0.79）%比较未见统计学差异（P＞0.05）。见表4、图2。

表3 两组患者治疗前后CD4+CD28-T细胞比例（±s）

表3 两组患者治疗前后CD4+CD28-T细胞比例（±s）

图1 流式细胞仪检测试验组治疗前后CD4+CD28-T细胞的比例

表4 两组患者治疗前后CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例（±s）

表4 两组患者治疗前后CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例（±s）

组别治疗前CD4+CD25+FoxP3+T细胞（占CD4+T细胞%）治疗后CD4+CD25+FoxP3+T细胞（占CD4+T细胞%）P值对照组 0.81±0.79 0.86±0.86 0.34试验组 0.62±0.57 0.85±0.87 0.20

3 讨论

AMI是严重危害人类健康的心血管疾病，急性期死亡率高，其中血胆固醇水平升高是冠心病死亡的主要危险因素。目前对于AMI患者，无论其LDL-C浓度基线如何，都应给予他汀类药物调脂治疗。辛伐他汀不但可以竞争性抑制羟甲戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）活性，同时在有效降低LDLC同时可以减少冠心病事件的发生[4]，减少患者的死亡率及心血管事件，他汀类药物还具有多效性包括抗炎、抗氧化、抗增殖和抗血小板等作用[5]。依折麦布是NPC1L1抑制剂。NPC1L1是位于空肠和回肠近端刷状缘的肠上皮细胞，是胆固醇主要吸收部位。在NPC1L1缺陷小鼠进行研究发现，其肠道对胆固醇的吸收减少70%[6]。有研究报道，依折麦布本身并不能明显改善动脉粥样硬化或血管事件，而他汀类药物与依折麦布联合应用比单药治疗对胆固醇的抑制作用更为有效[7]。此外，依折麦布和他汀类一样，具有抑制炎症因子和单核细胞迁移等作用。Liuzzo等[1]发现，AS损伤处聚集的T淋巴细胞主要是CD4+CD28-T细胞，该细胞亚群具有高效的促炎特征,可产生高水平γ干扰素（INF-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），并激活单核细胞和巨噬细胞，从而引起下游炎症反应，可溶解内皮细胞和损伤平滑肌细胞，且与急性冠脉事件的再发生有相关性[8]。CD4+CD25+Foxp3+主要为天然CD4+CD25+调节T细胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg）并且与自身免疫性疾病、变态反应、感染及肿瘤免疫等相关。Mor等[9]发现，CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性冠脉综合征的患者中是减少的。CD4+CD25+Foxp3+Treg可以通过细胞直接接触抑制靶细胞的活化、增殖及分化，并且可以通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子影响T细胞活化，以及通过竞争空间来调节T细胞分化等机制发挥其免疫抑制功能。其抗AS作用可能与分泌抑制性细胞因子（IL-10和TGF-β）或直接细胞间接触从而抑制初始T细胞的增殖来发挥其抗AS的作用[10]。所以，CD4+CD25+Foxp3+Treg可能对AMI患者斑块的稳定发挥重要作用。本研究通过对AMI患者外周血T淋巴细胞亚群比例研究发现,辛伐他汀联合依折麦布治疗15 d，CD4+CD28-T占CD4+T细胞百分比下降（P＜0.05），而单用辛伐他汀无变化，提示对于AMI患者辛伐他汀联合依折麦布治疗具有协同抗炎作用。

图2 流式细胞仪检测试验组治疗前后CD4+CD25+FoxP3+T细胞的比例

在冠状动脉粥样硬化进程中炎症及免疫因子广泛参与并发挥重要作用。其中调节性T细胞可能在AMI的进程中起作用。辛伐他汀联合依折麦布能够使AMI患者CD4+CD28-T淋巴细胞亚群降低，可能较单用辛伐他汀有额外获益。但本研究样本量较小，需加大样本量进一步探讨其可能机制。

［1］Liuzzo G，Goronzy JJ，Yang H，et al.Monoclonal T-cell proliferation and plaque instability in acute coronary syndromes.Circulation，2000，101：2883-2888.

［2］Piccirillo CA，Thornton AM.Cornerstone of peripheral tolerance: naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells.Trends Immunol，2004，25：374-380.

［3］Kastelein JJ，Akdim F，Stroes ES，et al.Simvastatin with or without ezetimibe in familial hypercholesterolemia.N Engl JMed，2008，358：1431-1443.

［4］Nixon JV.Who should receive a statin drug to lower cardiovascular risk Does the drug and the dose of the drug matter?Vasc Health Risk Manag，2006，2：441-446.

［5］Davignon J，Leiter LA.Ongoing clinical trials of the pleiotropic effects of statins.Vasc Health Risk Manag，2005，1：29-40.

［6］Altmann SW，Davis HR Jr，Zhu LJ，et al.Niemann-Pick C1 Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption.Science，2004，303：1201-1204.

［7］Prospective Studies Collaboration，Lewington S，Whitlock G，et al. Blood cholesterol and vascular mortality by age，sex，and blood pressure：a meta-analysis of individual data from 61 prospective studies with 55 000 vascular deaths.Lancet，2007，370：1829-1839.

［8］Liuzzo G，Biasucci LM，Trotta G，et al.Unusual CD4+CD28null T lymphocytes and recurrence of acute coronary events.JAm Coll Cardiol，2007，50：1450-1458.

［9］Mor A，Luboshits G，Planer D，et al.Altered status of CD4+CD25+regulatory T cells in patients with acute coronary syndromes.Eur Heart J，2006，27：2530-2537.

［10］Van ET，Van Puijvelde GH，Foks AC，et al.Vaccination against Foxp3+regulatory T cells aggravates atherosclerosis.Atherosclerosis，2010，209：74-80.（收稿日期：2015-01-21）

Study on effects of Simvastatin combined with Ezetim ibe on proportions of Tlymphocyte subpopulations in patientw ith acutemyocardial infarction

Study on effects of Sim vastatin combined with Ezetim ibe on proportions of Tlym phocyte subpopulations in patient with acutemyocardial infarction

WEIHong，WANG Jing-ping，CHAIXiao-hong，etal.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

WANG Jing-ping，E-mail：1787064049@qq.com

ObjectiveTo compare the effects of Simvastatin combined with Ezetimibe and Simvastatin alone on proportions of peripheral blood CD4+CD28-and CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells in patients with acute myocardial infarction（AMI）and explore the effects of Simvastatin combined with Ezetimibe in AMI.Methods40 AMI patients that were hospitalized and treated in the intensive care unit of Shanxi Cardiovascular Hospital from April 2014 to November 2014 were selected and divided randomly into two groups：the control group and the experimental group，patients in the control group（n=20）were given 40 mg Simvastatin once a day in the evening，while patients in the experimental group（n=20）were given 40 mg Simvastatin once a day in the evening and 10 mg Ezetimibe once a day.For all patients，proportions of peripheral blood CD4+CD28-and CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells were detected by flow cytometry before treatment and 15 days after treatment，respectively.ResultsThere was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD28-T cells in CD4+T cells before treatment（95.41±5.24）%and 15 days after treatment（95.07±2.24）%in the control group，while for the experimental group，the percentage of CD4+CD28-T cells in CD4+T cells 15 days after treatment（91.72±4.98）%decreased compared to that before treatment（93.55±6.43)%，with statistical significance（P＜0.05），there was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells before treatment（0.81±0.79）%and 15 days after treatment（0.86±0.86）%in the control group，and for the experimental group，there was no statistical significance（P＞0.05）regarding percentages of CD4+CD25+FoxP3+T cells in CD4+T cells before treatment（0.85±0.87）%and 15 days after treatment（0.62±0.57）%.Conclusion Application of Simvastatin combined with Ezetimibe in AMI patients can down-regulate peripheral blood CD4+CD28-T lymphocytes but has no significant impact on CD4+CD25+FoxP3+T lymphocytes.

Acute myocardial infarction； Coronary atherosclerotic； CD4+CD28-regulatory T

王敬萍，E-mail:1787064049@qq.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.05.011

R542.2+2

A

1672-5301（2015）05-0425－04