乳清中淀粉样蛋白A与奶牛隐性乳房炎相关性研究

尹柏双　王秋竹　付连军等

摘要：为研究不同程度奶牛隐性乳房炎发病与乳清中淀粉样蛋白A（SAA）含量变化的关系。选取8头健康奶牛和24头患轻、中、重度隐性乳房炎奶牛为试验动物，采集乳样，分离乳清，利用Elisa SAA检测试剂盒测定样品中SAA含量。结果表明，随着隐性乳房炎病情加重，乳汁体细胞数的增加，乳清中SAA含量逐渐升高，与健康对照组相比差异呈显著或极显著（P﹤0.01或P﹤0.05）。结果表明，乳清中SAA含量变化与隐性乳房炎发病具有一定相关性，乳腺损伤程度和乳汁体细胞数增加与乳清中SAA含量呈正相关。

关键词：奶牛；隐性乳房炎；乳清；淀粉样蛋白

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3705-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.032

Abstract： In order to study on relationship recessive mastitis of dairy cows with amyloid protein A in the whey. 8 healthy cows and 24 cows with light， moderate， severe recessive mastitis were randomly divided into 4 groups. To collect milk and separate whey， SAA content was detected by Elisa SAA kit. The results showed that the content of the SAA in whey was increased significantly with the aggravation of recessive mastitis， increase the milk somatic cell count， compared with the healthy control group（P﹤0.01 or P﹤0.05）. The results indicated that the change of the SAA content in whey with recessive mastitis incidence has certain correlation， degree of breast injury and increase of milk somatic cell counts were positively correlated with the SAA content in whey.

Key words： cows； recessive mastitis； whey； amyloid protein

奶牛隐性乳房炎可引起奶牛产奶量下降，牛奶品质降低，养殖成本增加，产后发情延长，妊娠时间推迟，给奶牛养殖业带来巨大经济损失，是危害奶牛养殖业最严重的疾病之一[1]。血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A，SAA）是一类多基因编码的多形态蛋白家族，属于急性期反应蛋白，炎症或感染急性期SAA迅速升高，在疾病的恢复期迅速下降[2，3]。研究发现，SAA在细菌感染时升高[4]；在微弱的炎症刺激时SAA可作为轻微炎症刺激的判定指标[5]。奶牛隐性乳房炎发病与微生物感染、机械性和物理性损伤引起的乳腺炎性反应密切相关，本试验研究乳清中SAA与不同程度奶牛隐性乳房炎发病的关系，为隐性乳房炎快速诊断方法的建立提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 通过乳汁体细胞计数监测后将年龄、胎次、产奶量、泌乳期等指标相近的健康奶牛8只和患不同程度奶牛隐性乳房炎奶牛24只，由吉林市某奶牛场提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 淀粉样蛋白A（SAA）测定试剂盒购于南京建成生物试剂研究所；Fossmatic 5000型体细胞计数仪（FOSS 公司，丹麦）；Varioskan 酶标仪（Thermo 公司，美国）；离心机（Sigma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组 通过乳汁体细胞计数监测后将试验奶牛分成健康对照组（8只，SCC﹤10×104 个/mL）、轻度隐性乳房炎组（8只，50×104个/mL﹤SCC﹤150×104个/mL）、中度隐性乳房炎组（8只，150×104个/mL﹤SCC﹤500×104个/mL）、重度隐性乳房炎组（8只，SCC>500×104个/mL）。

1.2.2 乳样采集 采集试验奶牛的乳汁，采样前对乳区进行清洗，然后用70%的酒精消毒乳区，弃掉头3 把乳汁，分别采乳10 mL装入无菌试管中，将采集的乳样放到冰盒中，带回实验室检测。

1.2.3 乳清制备 将采集的乳样3 000 r/min离心5 min，除去上层乳脂，然后于16 000 r/min高速离心机中离心10 min，去除沉淀，保留上清液，4 ℃保存，待测。

1.2.4 检测方法 乳汁体细胞计数采用体细胞计数仪测定，淀粉样蛋白A（SAA）含量采用SAA Elisa试剂盒测定，在酶标仪上450 nm 比色测定OD值，根据试剂盒说明绘制标准曲线后计算SAA含量。

1.2.5 数据处理 采用SPSS 17.0数据分析系统做单因素方差分析，结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 乳清中淀粉样蛋白A（SAA）标准曲线及回归方程

通过ELISA SAA检测试剂盒检测5个浓度梯度的SAA的OD450 nm，利用ELISA Calc回归/拟合软件进行分析。由图1可知，拟合直线回归方程为：Y=0.184 33X+0.001 08，r2=0.999 4，浓度与吸光值线性回归良好，表明该方法检测样品值可信度较高。

2.2 乳清中淀粉样蛋白A（SAA）含量

由表1和图2可知，患轻度乳房炎奶牛乳清中SAA含量为（3.88±0.57） μg/mL，与健康对照组比较升高显著（P﹤0.05）；患中、重度乳房炎奶牛乳清中SAA含量较健康对照组显著升高（P﹤0.01）。随着乳房炎病情加重，乳汁体细胞数增加，乳清中SAA含量逐渐升高，表明乳腺损伤程度和乳汁体细胞数增加与乳清中SAA含量呈正相关。

3 讨论

SAA主要由肝细胞合成与降解，机体受到炎症、感染、损伤等刺激后产生白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等一系列细胞因子，调控SAA的合成[4，6-8]。肝内合成的SAA释放入血后，迅速与高密度脂蛋白（HDL）结合[9]，参与内毒素的解毒以及胆固醇的代谢和转移[10]、抑制免疫反应[11]、诱导前列腺素I2的合成等多种生理、病理反应[12]。有研究表明，奶牛在发生炎症反应时血清SAA表达量在急性炎症时大量增加，乳房炎发病时血清中SAA含量发生改变[13]。吕英等[14]报道，人工感染金黄色葡萄球菌引起山羊隐性乳房炎时，血清SAA在感染后血清中的浓度急剧升高，乳中SAA较感染前显著升高。杨永新等[15，16]报道，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌性乳房炎奶牛血浆中SAA的表达量增加。杨洪森[17]研究表明，家兔乳头管灌注金黄色葡萄球菌和大肠杆菌后引起乳房炎家兔血清中SAA的表达量增加。

本研究表明，患隐性乳房炎奶牛乳清中SAA含量较健康组显著升高，且随着乳房炎病情加重，乳清中SAA含量逐渐升高。究其原因可能与奶牛乳房炎发病时乳汁中体细胞数量、IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量增加，调控SAA合成增多相关，且随着乳房炎病牛症状加剧，IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量逐渐增加，SAA合成也随着增多[18，19]。乳清中SAA含量变化与隐性乳房炎发病具有一定相关性，随着乳腺损伤程度的加剧、乳汁体细胞数的增加、炎性细胞因子含量的增多，乳清中SAA含量显著升高。

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