非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因突变研究

王旭洲 陈炜生 余英豪

肺癌是当前最常见的恶性肿瘤之一，也是导致死亡的主要原因，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占所有肺癌病例的85%以上[1,2]，目前，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、动物微管相关蛋白4与间变性淋巴瘤激酶融合基因（echinodem microtubule associated protein like 4-Anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）等相关位点突变检测研究已经成为肺癌分子靶向治疗的热门方向，相关的靶向抑制剂吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼目前也广泛应用于临床，并显示其较好的治疗效果[3-6]。ALK靶向药物克唑替尼（Crizotinib）临床前试验中将荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization,FISH）作为EML4-ALK融合基因的检测方法。本文拟通过对NSCLC肿瘤组织EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变状态进行研究，着重探讨联合运用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）/蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS）/FISH技术检测EML4-ALK基因突变状态的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集南京军区福州总医院病理科2013年2月-2014年3月间确诊的NSCLC 115例，其中男性71例，女性44例；年龄37岁-76岁，平均51.3岁；115例标本中，肺原位腺癌，即以往分类称为细支气管肺泡癌（bronchioloalveolar carcinoma,BAC）33例、其他类型腺癌66例、鳞癌9例、大细胞癌7例。按TNM分期标准：I期41例、II期39例、III期24例、IV期11例。所有患者术前均未接受过抗肿瘤治疗。选取标准：（1）治疗前病理检查明确诊断为NSCLC，且组织石蜡标本保存完整；（2）无相关禁忌症，治疗前没有发现远处转移；（3）入院前未接受放化疗等相关治疗，有可供观察的影像学及其相关临床治疗资料。

1.2 临床病理学资料 所有检测病例均收集手术切除标本，根据2011年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南进行标本检查和选取活检材料，组织标本均经10%中性福尔马林溶液固定处理、石蜡包埋、切片和HE及免疫组化染色，由两名有经验的病理医师进行诊断及病理分型。

1.3 材料与试剂 免疫组化染色采用SP法，兔抗人ALK单克隆抗体（克隆号D5F3）及其试剂盒均为即用型，购自美国Cell Signaling Technology,Inc（CST）公司。活检组织DNA提取试剂为MagCore公司、RNA提取试剂为QIAGEN公司产品；RNA逆转录DNA，EML4-ALK融合基因21位点（表1）突变以及EGFR突变基因检测均为厦门艾德公司试剂；FISH检测EML4-ALK试剂为杭州极地基因生物技术公司产品。

1.4 免疫组化检测 染色步骤按照试剂盒说明书进行，新鲜配制DAB显色剂显色。每批染色设阳性和阴性对照，阴性对照以PBS取代I抗，阳性对照为已知阳性片。EML4-ALK（D5F3）在NSCLC组织中阳性表达为细胞质和（或）细胞膜着色。每例切片随机观察5个高倍视野，按阳性细胞百分比及着色强度综合计分做半定量积分法判断结果。

1.5 组织RNA的提取和逆转录DNA 组织RNA的提取：切取组织样品5 μm-10 μm（样品表面不要接触空气），二甲苯脱蜡，混匀10 s；室温下离心2 min，吸去上清，加入1 mL无水乙醇，震荡混匀，室温下离心2 min，吸去上清，室温或37 ℃晾干，沉淀中加240 μL Buffer PKD和10 μL蛋白酶K，56 ℃孵化15 min，80 ℃孵化15 min，降至室温后，加入1/10体积的DNase Booster Buffer 25 μL和10 μL DNase I原液，迅速离心，室温孵育15 min加入500 μL Buffer RBC，并充分混匀，加1,200 μL无水乙醇，取700 μL样品转移至MinElute离心柱里≥10,000 rpm离心15 s，弃废液，重复上一步直到全部样品都转移到MinElute离心柱里。加入500 μL Buffer RPE，≥10,000 rpm离心15 s，弃废液。加入500 μL Buffer RPE，≥10,000 rpm离心2 min将柱子放入干净的2 mL收集管，全速空管离心5 min，柱子转移到干净的1.5 mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加14 μL-30 μL RNase-free水，离心1 min收集RNA。

表1 EML4-ALK（ARMS方法）融合基因检测类型Tab1 EML4-ALK (ARMS) fusion gene detection type

逆转录DNA：取逆转录反应液18.5 μL，逆转录酶0.5 U；加入RNA样品6 μL；42 ℃保温1 h；95 ℃保温5 min后冰上冷却，得到cDNA溶液进行荧光定量PCR检测。

1.6 ARMS法 每管试剂均按照每测试中含35 μL反应液和0.3 μL Taq酶的比例，震荡混匀15 s，快速离心15 s，以每管35 μL分装到PCR反应管中。分别加入cDNA 5 μL，按照第一阶段：95 ℃ 5 min 1个循环；第二阶段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 15个循环；第三阶段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s 31个循环；在第三阶段60 ℃时收集FAM信号，执行荧光定量PCR程序。探针收集模式设置为Reporter Dye: FAM；Quencher Dye: TAMせ/VIC；Passive Reference:NONE。

1.7 FISH法 参照产品说明中操作步骤进行试验。

1.8 统计学方法 采用SSPS 13.0统计软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC中EML4-ALK（D5F3）表达 115例NSCLC中32例有D5F3表达，83例未见表达，总表达率为27.8%；其中IHC 1+6例（5.2%）；IHC 2+ 15例（13%）；IHC 3+ 11例（9.6%）。

2.2 ARMS法EML4-ALK融合基因突变情况 115例中27例检出EML4-ALK融合基因突变，突变率为23.5%，对比IHC结果：IHC 1+为3例（2.6%）（P＜0.05）；IHC 2+为13例（11.3%）（P＜0.05）；IHC 3+为11例（9.5%）（P＞0.05），有88例未检出EML4-ALK融合基因（P＞0.05）（图1）；其中IHC 3+的11例均检测出EML4-ALK融合基因突变；阳性表达率符合率为100%，83例IHC未表达的病例也均未检测出EML4-ALK融合基因。EML4拼接EML4-ALKvariant 1外显子13 variant 3a/b-/-/ins69/-/-/-/EML4-ALKvariant 3a/b外显子6 variant 1-/-/ins33/-/EML4-ALKvariant 2外显子20 variant 2-/-/ins18/-与ALK拼接外显子20的融合类型有23例；EML4拼接EML4-ALKvariant 5a/b外显子2-/ins117外显子17 ins68与ALK拼接外显子20的融合类型有4例；上述两种同时存在的有3例。

2.3 FISH法中EML4-ALK融合基因表达情况 115例中，23例检测出EML4-ALK基因位点融合，检出率为20%，其中对比IHC结果显示：IHC 1+为1例；IHC 2+为11例；IHC 3+为11例，有92例FISH未检出EML4-ALK融合基因；IHC 3+的11例均检测出EML4-ALK融合基因突变，阳性表达率符合率为100%，IHC未表达的83例中也均未检测出EML4-ALK融合基因（图2）。

2.4 ARMS法中EGFR基因突变情况 115例中共检测出EGFR基因突变53例（46%），其中19外显子del突变有32例；20外显子T790M耐药基因突变的有5例；21外显子L858R突变的有9例；21外显子L861Q突变的有6例；20外显子罕见S761I罕见基因突变的有1例。6例EGFR突变基因与EML4-ALK融合基因同时发生突变，而5例T790M突变的中有3例与其他位点同时存在。

3 讨论

EML4-ALK基因是NSCLC的一个潜在治疗靶点，目前已有了ALK抑制剂-克唑替尼[7,8]，克唑替尼同时也是MET/HGF受体酪氨酸激酶抑制剂。克唑替尼属于一种选择性ATP竞争性小分子抑制剂，c-Met/肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor,HGFR）和ALK酪氨酸激酶及他们的致癌变异体有抑制作用[8-11]。本研究显示ALK（D5F3）在NSCLC的表达率为27.8%，与相关报道[12,13]的数据接近。将IHC方法划分为1+/2+/3+不同的表达水平，通过不同分子技术进行进一步验证检测，发现AMRS和FISH检测得到如下结果：IHC 1+：6例，AMRS检测出3例，符合率为50.0%，FISH检测出1例，符合率为17.0%；IHC 2+：15例，AMRS检测出13例，符合率为87.0%，FISH检测出11例，符合率为73.3%；IHC 3+ 11例，AMRS检测出11例，符合率为100.0%，FISH检测出11例，符合率为100%；其EML4-ALK融合基因与蛋白表达呈正比关系，IHC 3+表达与AMRS和FISH的一致性为100.0%。说明运用ALK（D5F3）IHC对NSCLC病例进行筛查，就能对阴性及IHC 3+病例做出初步判断，再对IHC 1+以上病例进行分子病理验证，能够快速、准确对融合基因突变位点做出判断。同时从三种方法的符合率上也发现了IHC方法的不确定性，最终确定结果还需要以分子表达为依据。本文结果显示，RT-PCR与FISH法阳性率基本相似。但与PCR不同，FISH不能鉴别出不同的EML4-ALK融合基因变异体，且成本更高，分离的荧光信号不易解释。运用AMRS技术检测EML4-ALK融合基因有着敏感性较强的优势，且能够区分相应的融合基因分型[12]，结合FISH方法可以对肺癌，特别是NSCLC中EML4-ALK融合基因状态做出准确推测。

图1 HE与IHC显色对应情况。A、B：实性腺癌（HE染色，×10）；C：管状腺癌（HE染色，×20）；D：IHC 2+（IHC SP法，×10）；E：IHC 3+（IHC SP法，×10）；F：IHC 1+（IHC SP法，×20）；图片D、E、F分别与HE图片A、B、C相对应。Fig1 The HE and IHC color correspondence. A,B: solid adenocarcinoma (HE staining,×10); C: tubular adenocarcinoma (HE staining,×20); D:IHC 2+ (IHC SP method,×10); E: IHC 3+ (IHC SP method,×10); F: IHC 1+ (IHC SP method, ×20). Image D,E,F,are corresponding to image A,B,C,respectively. HE: hematoxylin-eosin staining; IHC: immunohistochemistry.

图2 FISH双分离探针信号表达。A：FISH双分离探针（IHC 3+）阳性信号表达；B：FISH双分离探针（IHC 1+）阴性信号表达。Fig2 FISH dual probe signal separation expression.A: FISH dual separation of the probe (IHC 3+) positive signal representation; B: FISH dual probe (IHC 1+) signal separation negative expression. FISH: fluorescence in situ hybridization.

以往在肺癌检测相应的驱动基因中通常认为EGFR与EML4-ALK融合基因存在排斥性，不能同时出现其EGFR与EML4-ALK融合基因的同时突变[13-15]。我们通过研究发现了6例上述两种驱动基因的同时突变，在AMRS方法检测的同时，应用FISH方法进行了验证，均显示相同结果。因此，我们认为EGFR与EML4-ALK融合基因双突变并非完全排斥，只是这种情况存在的几率偏低。

另外，在NSCLC中融合基因阳性率是否存在地理或种族差异；EML4-ALK融合基因是否确实是克唑替尼疗效的预测分子；克唑替尼是否比现有的治疗手段有更明显的客观疗效和生存期优势；对共存突变的NSCLC患者，多靶点抑制剂会不会是更好的选择仍有待于进一步研究。但融合基因作为NSCLC新的驱动基因亚型，以及对EML4-ALK、ROS1、RET等基因作用研究不断深入，充分表明了融合基因在NSCLC中的重要作用[16-18]。