生鲜乳检测技术的研究进展

杜兵耀　臧长江　马晨　李昊　杨开伦　余雄

摘 要：优质的生鲜乳是奶业发展的必然方向，而生鲜乳中乳脂率、乳蛋白率、菌落总数和体细胞数是衡量优质乳的核心指标， 这些指标既关系到质量安全与消费者的健康，又决定着牛奶的经济价值与核心竞争力，其中乳脂肪和乳蛋白的含量与组成是牛奶营养品质的主要物质基础，菌落总数是环境卫生指标，体细胞数是奶牛健康状况指标。近年来，国内外牛奶质量安全事件频发，严重威胁人类健康。笔者通过对生鲜乳的检测技术的文献研究，提出相应的建议，这对提高生鲜乳质量安全以及保证人们的身体健康和生命安全具有十分重要的意义。

关键词：生鲜乳；检测技术；质量安全

中图分类号：TS252.7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.018

Research Progress on Testing Technology of Fresh Milk

DU Bing-yao， ZANG Chang-jiang， MA Chen， LI Hao， YANG Kai-lun， YU Xiong

（College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830052， China）

Abstract： High-quality fresh milk is the inevitable direction of developing dairy industry， while butterfat rate， milk protein rate， the total number of colonies and the number of somatic cells in fresh milk are the core indicators of measuring high-quality milk. It involves both the quality and safety and the health of consumers， and decides the economic value and the core competitiveness of milk. The milk fat and milk protein content and composition are the main material basis of milk nutrition quality and the total number of colonies is an indicator of environmental health and the number of somatic cells is the cow health indicator. In recent years， milk quality security incidents at home and abroad occur frequently， posing a serious threat to human health. In this paper， based on the literature research of testing technology of the fresh milk， the corresponding proposal is put forward to improve the quality and safety of fresh milk and ensure people's health and life safety.

Key words： fresh milk； testing technology； quality and safety

近几年牛奶质量安全事件时有发生，尤其是2008年发生的“三鹿奶粉事件” ，2009 年底又出现多起奶制品三聚氰胺超标案件，生鲜乳质量安全已经成为决定我国奶制品行业生死存亡的问题[1]。国家采取各项检测措施不断加强生鲜乳质量安全监管，体制更加健全，保障更加有力，也取得了明显效果。本研究主要从霉菌毒素、药物残留、体细胞数和菌落总数等方面进行综述[2]。

1 生鲜乳霉菌毒素的检测技术

霉菌毒素污染是食品质量安全的重要问题，对人类的健康构成了严重的威胁。目前，世界各国已经开始积极检测牛奶中霉菌毒素的污染状况，大约有20种在食品和饲料中的含量较为显著，其中的玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素等因具有高毒性和致癌性而备受关注。目前检测霉菌毒素的方法主要有酶联免疫法、薄层层析法、高效液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法等[3]。

1.1 酶联免疫法在生鲜乳霉菌毒素检测中的应用

酶联免疫法是当今最具代表性的快速、高效的检测方法，且方法简单易于操作，被广泛应用于霉菌毒素分析检测[4]，但由于该方法易出现假阳性等缺点限制了其进一步应用[5]。

1.2 薄层层析法在生鲜乳霉菌毒素检测中的应用

薄层层析法（TLC）是对霉菌毒素进行定性或定量检测的方法[6]，浓缩后的待测样品提取液通过单向展开法在薄层上分离后， 对霉菌毒素的 Rf值和荧光颜色进行观察分辨， 再根据薄层色谱板上显示荧光的最低检出量进行定量。利用薄层色谱法检验得出的结果准确， 操作方法简单，但该方法运用的试剂多， 检验周期较长。

1.3 高效液相色谱法在生鲜乳霉菌毒素检测中的应用

高效液相色谱法较早用于霉菌毒素的检测，经常用的检测器主要有荧光、二极管阵列、紫外等检测器，是目前使用较为广泛的霉菌毒素的检测方法。采用高效液相-荧光检测法检测生鲜乳中赭曲霉素A，样品可以跳过液-液提取的步骤，浓缩后经过免疫亲和柱洗脱，进行检测，不需要使用有毒试剂（有机氯等）。采用高效液相-荧光检测法时，被检测物要具有很好的荧光特性。该方法易于操作、灵敏性高，但是只能检测一类或者一种霉菌毒素。

1.4 超高效液相色谱串联质谱法在生鲜乳霉菌毒素检测中的应用

随着液质联用法的不断发展和完善，超高效液相色谱串联质谱法因其灵敏度高、特异性强、选择性高等特点已成为霉菌毒素分析最普遍的方法。利用超高效液相色谱串联质谱法可同时测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1等多种霉菌毒素。但是该方法具有仪器设备比较昂贵、可信性差、检测成本高等缺陷，有待改进。

2 生鲜乳中药物残留的检测技术

在兽医临床上常用药物治疗奶牛的各种疾病，而由此引起的药物残留是一个全球性的问题。药物在生鲜乳中的残留会通过食物链传播，从而严重危害人类的健康。生鲜乳中药物残留的检测是保证生鲜乳质量安全的重要环节，因此建立对生鲜乳中药物的定性定量检测方法十分重要。药物残留主要包括激素类药物残留、农药残留、抗生素等。

2.1 生鲜乳中激素类药物残留的检测技术

激素类药物（Hormone drugs）是把人体或动物激素（包括与激素结构、作用原理相同的有机物）作为有效成分的药物。在奶牛饲养过程中，为了促进奶牛生长、提升牛奶的产量，奶农会违规使用激素类药物，从而导致牛奶中激素的残留。当机体摄入含有激素类药物的生鲜乳后，残留的激素会对机体的健康构成很大的威胁，残留的激素中生长激素、甲状腺激素和性激素对机体造成的影响最大。当食用的生鲜乳或其制品残留有性激素时，会增加患更年期乳腺癌或者前列腺癌的几率。在检测生鲜乳中激素类药物残留时，因为激素类药物结构相似、理化性质相近，其残留程度和生理水平接近，所以对检测结果的准确性要求较高，并且需要高度灵敏的分析设备和有效的样品前处理。因此需要利用可靠的检测技术来测定生鲜乳中激素类药物的残留。目前，生鲜乳中的激素类药物残留的检测方法主要分为免疫分析法和色谱质谱分析法[7]。

2.1.1 免疫分析法检测生鲜乳中激素类药物的残留 免疫分析法是利用抗体和抗原的特异性结合来检测生鲜乳中激素类药物残留的方法，可分为酶联免疫分析法（ELISA）和放射免疫分析法（RIA）。酶联免疫分析法可以满足生鲜乳中激素残留的检测要求。但是该方法的检测结果易出现假阳性，当出现初筛阳性结果时要用其他方法验证。放射免疫分析法，是将灵敏度高的放射性示踪技术和特异性很高的免疫化学技术结合起来，可以对微量的生理活性物质进行检测定量，该方法将免疫分析和放射性标记相结合，可以对极其微量的生物活性物质进行检测，具有一定的优越性且样品处理简单，具有高度的特异性和灵敏性，但是该方法作为单一的测定方法只可以检测几种特定的激素类药物，且其半衰期较短，并具有少量辐射，从而限制了该方法的广泛应用。

2.1.2 色谱质谱分析法检测生鲜乳中激素类药物的残留 色谱法主要是依据待测样品在相应相态的合理性分配、吸附、交换、排斥渗透等性质的不同，达到分离的作用，然后顺序检测各组的含量。主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、 高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS）[8]。气相色谱法（GC）是以气体作为流动相的柱色谱分离分析方法，气象色谱分析具有高度的灵敏性和很强的选择性，操作简单，但是该方法使用的样品需要气化，定性能力差，应用范围受到限制。气相色谱-质谱法（GC-MS）分离效能高，选择性好，灵敏度高，定量和定性能力强，但是该方法使用时，样品前处理要求高、衍生过程繁琐、样品需要气化、设备昂贵且使用范围有限。高效液相色谱法（HPLC）分辨率高、速度快、使用范围广，但是该方法分离效率低、定性能力差、色谱柱易污染。液相色谱-质谱法（LC-MS）不需对目标物进行衍生处理，速度快检测限低，操作简便，而且灵敏度高，测量范围广，但是该方法对样品前处理要求高，设备昂贵。除以上目前所普遍使用的方法外，随着科技的进步，许多新的免疫技术逐步被开发并应用于药物残留的检测，如荧光偏振免疫法、胶体金免疫法、时间分辨荧光法、动注射免疫法。

2.2 生鲜乳中兽药残留的检测技术

兽药在畜牧业的大量应用，不可避免地造成生鲜乳中药物的残留。通过食物链被人们长时间的摄入后，会对人体健康产生较大的危害，主要表现以下几个方面：（1）有些人对抗生素过敏，摄入含有抗生素的生鲜乳时会产生不同程度的过敏反应，严重的会危及生命；（2）长期摄入含有抗生素的生鲜乳等于长期摄入了低剂量的抗生素，会使机体内的细菌产生耐药性；（3）生鲜乳中残留兽药会影响其品质，同时也影响其本身的发酵，使其深加工产品的产量和质量降低，给生产者造成经济损失。

随着生鲜乳兽药残留问题变得日益严重，兽药残留检测技术也得到全面的发展。目前，有关生鲜乳中检测兽药残留的主要方法有：免疫分析法、微生物检测法[9]。

2.2.1 免疫分析法在生鲜乳兽药残留的检测中的应用 根据标记物的不同，将免疫分析法分为酶联免疫分析法、放射性免疫分析法、荧光免疫分析法、免疫层析法等[10]。目前用于检测兽药残留的免疫分析方法主要有两类：一类是把抗原抗体识别作为核心反应，主要是酶联免疫吸附法，另一类是以受体配体识别作为核心反应，利用配体受体间的特异性来进行检测的方法，该方法变异系数低，灵敏度高。

2.2.2 微生物检测法在生鲜乳兽药残留的检测中的应用 微生物检测法又称微生物抑制试验（MIT），是最早应用于检测生鲜乳中抗生素的方法，是依据抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用来定量或者定性地确定样品中的抗生素残留[11]。常用的微生物检测技术有杯碟法（CP）、纸片法（PD）、氧化三苯基四氮唑法（TTC）[12]。生鲜乳中兽药残留的检测以氧化三苯基四氮唑法（TTC）和纸片法（PD）为主。氧化三苯基四氮唑法是为定性检测生鲜乳中兽药残留的方法，该方法简单、无特殊设备，但用该方法检测较为耗时[13]。纸片法（PD）常用的方法有枯草杆菌纸片检测法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法[8]。枯草杆菌纸片检测法是将滤纸圆片吸满待测乳样后放在接种枯草杆菌的琼脂平皿上，然后放入一个含有标准抗生素的阳性对照圆片。将培养皿置于32 ℃下培养17～24 h后，观察有无抑菌圈的出现，为了确定阳性物质是否是青霉素，需对加热后的乳样用青霉素酶处理，来灭活乳样中的青霉素，然后再进行检测。该方法检测的结果易出现假阳性，且耗时较长[12]。

2.3 生鲜乳中农药残留的检测技术

众所周知，农药是人们向环境中投放的数量大、毒性广的一类属于毒害性质的化学物质，最终直接暴露在生态环境中。残留、富集是农药不可避免的环境行为。因此，农药残留是造成食品质量安全问题的重要因素之一，其化学成分对人体具有较大的毒害性，同时人们也一直重视生鲜乳的农药残留问题。农药残留的检测技术是对复杂混合物的微量组分进行准确分析的技术，此项技术要求微量操作手段，特异性强，灵敏度高。由于农药品种多，性质和化学结构形式多样且其组成成分复杂，有些农药还需要对其降解物进行检测。农药的转换物和代谢物等也给生鲜乳中农药残留的检测提出了更高的要求，需要灵敏度高、可行性好的检测技术。目前农药残留检测技术常用的方法有仪器分析法、免疫分析法、酶抑制法、生物传感器法等[13]。

2.3.1 仪器分析法在生鲜乳农药残留检测中的应用 气相色谱、液相色谱分析法是实验室检测生鲜乳中农药残留最常规的方法[14-15]，此外，还有色谱-质谱联用（GC/HPLC-MS）、 SFC等高效快速检测技术已进入实用阶段。气相色谱法（GC）是目前应用最为广泛的方法，大约70 %的农药残留检测是用气相色谱法来进行的。超临界流体色谱法是用超临界流体为流动相的检测技术，能弥补气相色谱法和色谱-质谱联用法的不足。仪器分析方法未大量用于生鲜乳的现场检测，由于其对操作人员要求相对较高，仪器较为昂贵等缺点，使该方法的应用受到了限制。

2.3.2 免疫分析法在生鲜乳农药残留检测中的应用 生鲜乳中农药残留检测常用的免疫分析法有放射性免疫分析法、酶联免疫分析法和荧光免疫分析法。由于荧光免疫分析法存在非特异性问题，放射免疫分析法污染环境，尽管这两种方法灵敏度高，但是它们的技术程序较为复杂，需要特殊的仪器设备，因而限制它们的广泛应用。酶联免疫法操作简单，但是该方法易出现假阳性且不适用于大量样品的分析。

2.3.3 酶抑制法在生鲜乳农药残留检测中的应用 酶抑制法是较为成熟的一种生鲜乳中农药残留快速检测技术。酶抑制法已经广泛应用于生鲜乳中农药残留的现场检测，成为仪器分析法的有效补充方法。虽然目前酶抑制法只能对有机磷类和氨基甲酸酯类农药进行测定，但仍是生鲜乳中农药残留快速检测的首选方法之一。酶抑制法的优点是快速、操作方法简单、无需仪器或仪器较为简单，适用于现场的定性和半定量测定及多样品的筛选检测。但该方法只适用于部分农药的快速检测，并且其灵敏度和所使用的酶、显色反应的时间和温度都有密切的关系，因此具有一定的局限性。

2.3.4 生物传感器在生鲜乳农药残留检测中的应用 生物传感器是目前农药残留检测技术中的研究热点，使用该方法检测的样品一般不需要前期处理，也不需要另外添加其它的试剂；样品的检测和被测成分的分离可以同时完成；可以实现对待测样品的实时监测和自动化的测量；样品的需要量少，并且可反复多次使用。但是生物传感器检测的重现性和结果稳定性存在着问题，影响了该技术的推广应用。

3 生鲜乳中体细胞数和菌落总数的检测技术

生鲜乳体细胞数（SCC）是指每毫升生鲜乳中所含的体细胞个数[16]。体细胞数是划分生鲜乳的品质、保证乳制品质量安全、诊断奶牛的乳房炎和检测奶牛饲养管理水平的重要参考指标。菌落总数（TBC）是指每毫升生鲜乳中含有的细菌个数。生鲜乳中的菌落总数是衡量生鲜乳质量安全的一个重要指标，它反映了生鲜乳质量的优劣。因此体细胞数和菌落总数的检测具有很重要的意义。目前生鲜乳体细胞检测常用的方法主要有镜检计数法、库尔特计数仪测定法、加利福尼亚细胞数测定法（CMT）、荧光显微镜计数法等。

3.1 镜检计数法在生鲜乳体细胞检测中的应用

镜检计数法是用生鲜乳定量涂片，然后根据镜检换算其中每毫升乳样中的体细胞数量，该方法准确，设备要求低，可用于校正分析仪，但该方法较费时，不能作为现场快速和大量样品时使用[17]。库尔特计数仪计数法可以直接读出每毫升样品的生鲜乳体细胞数，此方法前处理繁琐且时间长。加利福尼亚细胞数测定法（CMT）操作简单，价格相对低廉，能够现场快速判断出哪个乳头患有乳房炎。其测定原理是利用强碱和表面活性剂破坏体细胞膜，细胞破裂后释放出包含的内容物，进而交联或者与试剂或者乳成分相互作用生成絮状沉淀物或者生成凝块，根据生成的凝块或者沉淀的数量，可以衡量生鲜乳中体细胞数的范围。

3.2 荧光显微镜计数法在生鲜乳体细胞检测中的应用

荧光显微镜计数法采用的是荧光染色剂。此法相对标准方法背景较为清晰，但制片、镜检过程要占用大量的时间，因此不适合于大量快速的检测应用。

3.3 生鲜乳中菌落总数的检测技术

目前生鲜乳中菌落总数检测常用的方法主要有平皿菌落计数法、Bactoscan FC法、电阻抗法、生物发光ATP法[18]。

平皿菌落计数法是常用的活菌计数法，但该方法测得的结果小于实际数值。操作简单，重复性好，但是时间较长。Bactoscan FC法是检测分析生鲜乳的质量和组分的一种方法。该方法是针对单个细胞计数，准确、快速、耗时短，但是价格昂贵。电阻抗法检测细菌总数是根据微生物的生长代谢将培养基中的碳水化合物转化成氨基酸和乳酸等，根据仪器记录培养基的电阻抗波动的DT时间来检测微生物的数量，该方法检测周期短、操作简便。生物发光ATP技术，细胞内的ATP含量反映细胞的存活活力，当细胞处于受损或死亡状态时其ATP含量将下降或消失，生物发光ATP技术就是利用ATP生物发光细胞内的ATP值来计算活菌的数量[19]。

4 结论与展望

随着人们对高品质生鲜乳及乳制品的需求，快速、高效、准确的检测手段在生鲜乳及乳制品生产应用中对实现乳业生产过程的便捷高效的管理以及提高乳制品的质量具有重要意义。目前，不断出现的新检测技术因其存在的优越性和局限性限制了它们在乳制品行业中的应用。因此，以生鲜乳及乳制品的最终消费者为考虑对象，探索新型的检测技术，以便捷、高效、准确相结合为特点的检测技术将成为未来研究的主要方向。同时，探索先进的检测技术也是提高人们生活水平和乳制品行业竞争力不可缺少的。

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