不同发酵方法对预防鸡大肠杆菌病中药药效的影响

范寰　王建国　孟繁瑞　李秀丽　任卫科　池晶晶　李富强　田向学　郑成江　王文杰

摘 要：以植物乳杆菌为发酵菌株，研究其对预防鸡大肠杆菌病中药组方不同发酵工艺的临床药效的影响。结果表明，中药配方经完全发酵后不能抵抗大肠杆菌WW1对雏鸡的攻击，而植物乳杆菌发酵陈皮后的中药组方对感染大肠杆菌的雏鸡的保护率达到75%～93.75%，并且低剂量组优于中、高剂量组，每日给药剂量应不超过1 g·kg-1 bw。

关键词：植物乳杆菌；鸡大肠杆菌病；发酵；中药

中图分类号：S858.31 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.012

Influence of Different Fermentation Method on Pesticide Effect of Traditional Chinese Medicine against Chicken Colibacillosis

FAN Huan，WANG Jian-guo，MENG Fan-rui，LI Xiu-li，REN Wei-ke，CHI Jing-jing，LI Fu-qiang，TIAN Xiang-xue，ZHENG Cheng-jiang，WANG Wen-jie

（Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research，Tianjin 300384， China）

Abstract：In order to investigate the influence of different fermentation method on pesticide effect of traditional Chinese medicine against chicken colibacillosis， Lactobacillus plantarum strains was used for fermentation. The results show that traditional Chinese medicine after fully fermented cannot protect the chicken against the attack of Escherichia coli WW1. The protection rate of traditional Chinese medicine after Pericarpium citri reticulatae fermented reached 75%～ 93.75%，and the low dose group was better than that of the medium and the high dose group. So the daily dose should be no more than 1 g·kg-1 bw.

Key words：Lactobacillus plantarum； chicken colibacillosis；fermentation；traditional Chinese medicine

微生物发酵应用于中药炮制工艺中在我国已有千余年的历史。现代中药发酵技术是以传统的中药炮制发酵法为基础，利用微生态学的特殊性，并结合酶学工程所产生的一种中药高科技制药新工艺，在中药发酵过程中微生物发挥了强大的分解转化能力，产生了多种次生代谢产物，较大幅度地改变了药性，能降低毒副作用[1]，提高疗效，产生新药效，利于吸收、改善适口性[2]。

大量的研究表明，发酵中药应用于畜牧业生产具有“高效、量少、安全”等特点和优势[3]。刘春辉[4]对复方中药进行发酵，通过比较发酵前后的中药对奶牛乳房炎及生产性能的影响，结果发现发酵后的复方中药在降低奶牛乳房炎的发病率、增加产奶量和改善牛奶品质等方面均好于未发酵的复方中药制剂。韩战强等[5]的研究表明，发酵中药在提高母猪泌乳力、健康程度、仔猪生长速度、成活率、降低仔猪腹泻率等方面与对照组相比效果均显著提高。刘观忠等[6]的研究发现，无论是对肉仔鸡的生产性能还是对血液生化指标的影响，发酵中药组的使用效果均优于中药组。目前，对中药发酵的研究已从单味药发展到了组方药[7]。韩春杨等[8]的研究发现，中药发酵制剂组对肉鸡抗新城疫病毒的抗体效价、免疫器官指数和饲料利用率等指标均高于对照组，差异显著（P<0.05）。

本研究选取对肉鸡有益生作用的植物乳杆菌[9]，研究其对预防鸡大肠杆菌病中药组方不同发酵工艺的临床药效的影响，为益生菌发酵中药替代抗生素提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 受试菌株 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），天津市畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 预防鸡大肠杆菌病的中药组方 地锦草150 g、黄芩100 g、苦参100 g、苍术100 g、陈皮50 g。

1.1.3 受试动物 1日龄海蓝褐雏鸡180只，公母各半。饲养至7日龄，选择144只（公母各半）作为试验用鸡。将144只鸡平均分为9组，每组16只为1笼，公母各半。

1.1.4 发病菌株 鸡致病性大肠杆菌WW1，由天津市畜牧兽医研究所分离鉴定并保存。

1.2 方 法

1.2.1 预防鸡大肠杆菌病的全中药组方发酵 在含有MRS培养基的组方1中（含水量75%）添加10%活化好的植物乳杆菌（2.3×109 cfu·mL-1），38 ℃培养48 h。

1.2.2 预防鸡大肠杆菌病中药组方中陈皮的发酵 在初始pH值为8的MRS培养基中添加80 g· mL-1的陈皮，接种1%（V/V）活化好的植物乳杆菌（2.3×109 cfu·mL-1）35 ℃，培养时间30 h。

1.2.3 鸡大肠杆菌病人工模型的建立 在雏鸡8日龄时，每只雏鸡胸肌注射大肠杆菌培养液0.2 mL（8×109个菌·mL-1）。攻菌4 h后，大部分雏鸡出现沉郁、嗜卧、饮食减退，活动减少。随后陆续出现水样便，昏睡，饮食减少或废绝。24 h后开始陆续出现死亡。

1.2.4 临床药效试验 试验药物准备工作包括（1）全中药组方发酵物颗粒。将发酵药物与小麦粉以1/1的比例混合再加适量水制细粒，颗粒以等量玉米粉包裹，晾干成含生药25%的颗粒1 000 g备用。（2）全中药组方发酵物提取液。取制备好的颗粒400 g，加8倍量水，小火提取2次，每次15 min。合并提取液，过滤，浓缩至50%浓度（即含生药0.5 g·mL-1）。共制备200 mL，备用。（3）陈皮发酵后的中药组方颗粒。将方中陈皮粉碎，过孔径0.25 mm的筛，加入乳酸菌发酵（接种量20%，初始pH值自然，陈皮使用量8%，发酵时间36 h，温度35 ℃）。其余未发酵部分粉碎过孔径0.25 mm的筛，同发酵药物混合，并以中药∶小麦粉=1∶1的比例加入小麦粉，再加适量水和成团状，制细粒，再将制成的颗粒以等量玉米粉包裹制粒，成含生药25%的颗粒。共制成样品1 000 g，备用。（4）陈皮发酵后的中药组方提取液。取制备好的颗粒400 g，加8倍量水，小火提取2次，每次15 min。合并提取液，过滤，浓缩至50%浓度（即含生药0.5 g·mL-1）。共制备200 mL，备用。（5）全组方中药颗粒。将处方中各味药混合，粉碎，过孔径0.25 mm的筛，加等量小麦粉，制细粒；再将细粒以等量玉米粉包裹制粒，成含生药25%的颗粒，备用。（6） 全组方中药提取液。另取粉碎后的药物适量，水煎提取2次，每次15 min。过滤，浓缩至50%（即含生药0.5 g·mL-1），备用。（7） 对照药物盐酸环丙沙星颗粒。将盐酸环丙沙星片压碎、研细，加小麦粉，制成含量为4 mg·g-1的颗粒，共制备100 g，备用。（8） 对照药物盐酸环丙沙星溶液。另取盐酸环丙沙星1片（含盐酸环丙沙星250 mg），加蒸馏水50 mL，溶解，成5 mg·mL-1的溶液，备用。

全组方发酵的临床试验的药物剂量设置及给药方法。（1）发病前给药。如表1所示，设全中药组方发酵颗粒高、中、低3个剂量组，在攻菌前3 d给药，按每天0.6 g·只-1、0.4 g·只-1和0.2 g·只-1剂量，分2次给药。中药组方颗粒同样设置作为对比。对照药物盐酸环丙沙星颗粒给药剂量为每天每只鸡0.25 g，分2次给药。（2）发病后给药。如表2所示，攻菌4 h后，各组鸡开始发病时，改用饮水给药。给药剂量为，全中药组方发酵物提取液高中低剂量组分别为每天0.3 mL·只-1、0.2 mL·只-1和0.1 mL·只-1，分2次给药。中药组方提取液高中低剂量组给药剂量同上。盐酸环丙沙星溶液给药剂量为每天0.1 mL·只-1，连用3 d。

组方中陈皮发酵后的临床试验的药物剂量设置及给药方法。（1）发病前给药。如表3所示，设组方中陈皮发酵后组方中药颗粒高、中、低3个剂量组，在攻菌前3 d给药，按每天0.6 g·只-1、0.4 g·只-1和0.2 g·只-1剂量，分2次给药。中药组方颗粒同样设置作为对比。对照药物盐酸环丙沙星颗粒给药剂量为每天每只鸡0.25 g，分2次给药。（4）发病后给药。如表4所示，攻菌4 h后，各组鸡开始发病时，改用饮水给药。给药剂量为，组方中陈皮发酵后中药组方提取液高中低剂量组分别为每天0.3 mL·只-1、0.2 mL·只-1和0.1 mL·只-1，分2次给药。中药组方提取液高中低剂量组给药剂量同上。盐酸环丙沙星溶液给药剂量为每天0.1 mL·只-1，连用3 d。

1.2.5 疗效判定指标 因使用的致病性大肠肝菌WW1对雏鸡具有较高致死率，因此以致死率为指标评价药物的疗效较为简便直观。

2 结果与分析

2.1 全组方发酵中药对感染雏鸡的保护效果

如表5所示，雏鸡发病给药后，全组方发酵中药3个剂量组最终死亡数均高于对应的未发酵中药剂量组，相当于发病未给药的攻菌对照雏鸡死亡数，并且其死亡高峰出现在24 h内，明显较其他组严重。分析原因，可能是发酵后某些药物发生了量或质的变化，使得药物对发病鸡的死亡起到了加速作用。

未发酵中药组3个剂量鸡的死亡数均低于攻菌对照组，表明中药方大肠杆菌病具有较好的治疗作用。

2.2 陈皮发酵后的中药组方对感染雏鸡的保护效果

如表6所示，陈皮发酵后的中药组方高剂量组、陈皮发酵后的中药组方中剂量组、陈皮发酵后的中药组方低剂量组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、盐酸环丙沙星对照组、攻菌对照组和空白对照组雏鸡保护率分别为75.00%，75.00%，93.75%，68.75%，68.75%，75.00%，75.00%，56.25%，100.00%，各给药组与模型对照组比较，差异显著（P<0.05）。陈皮发酵后的中药组方与组方中药对鸡大肠杆菌病人工模型均有较好的治疗作用。其中陈皮发酵后的中药组方低剂量组作用最好，可作为临床推荐剂量。

从药物的作用方式来看（表6），陈皮发酵后的中药组方颗粒有较好的减轻发病、减少死亡的作用。可能是陈皮发酵产生的某些因子可抵抗大肠杆菌的感染和危害，使雏鸡发病症状轻、死亡率大大减少。从陈皮发酵后的中药组方3个剂量的数据分析，低剂量优于中剂量和高剂量，经计算颗粒高剂量、中剂量和低剂量组按体重计算分别为2.73，1.82，0.9 g·kg-1 bw，显然高中剂量组高于常用剂量范围0.2～1 g。处方中苦寒之品较多，过量给药反而可能会造成疗效的降低。因此，在临床使用时，每日给药剂量应不超过1 g·kg-1 bw为宜。

3 结论与讨论

地锦苦芩中药配方经完全发酵后不能抵抗大肠杆菌WW1对雏鸡的攻击，因此在预防鸡致病性大肠杆菌病中不适宜使用全方发酵的中药配方。植物乳杆菌发酵陈皮后的中药组方对感染大肠杆菌的雏鸡具有显著的保护作用，并且低剂量优于中、高剂量，每日给药剂量应不超过1 g·kg-1 bw。

益生菌作为对畜禽健康有利的活微生物，通过发酵对中药的生物转化作用巨大，它可以对单一中药有效成分或单味中药全成分进行生物转化，改变单味中药有效成分的含量和生物活性，改变中药提取物和中药复方生物活性[10]。陈雷等[11]研究发现益生菌发酵中药在防治鸡球虫病中有很好的效果。

大量研究表明，发酵菌在特殊的中药基质中也有可能产生新的代谢过程，因为中药中有些成分对微生物的生长代谢可能有促进或抑制作用，从而改变其代谢途径，产生新的药物成分；有些发酵中药利用的微生物本身就是非常好的药物，比如双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌等，他们本身就是一种益生菌，在动物机体肠道内可以产生消化酶、酸类，能够与病源微生物产生竞争性抑制作用，从而产生对动物有保健作用的物质，若再和其他一些药物作用后就可能达到良好的治疗效果，产生集中药、酶制剂、益生素于一体的产物了[12]。

中药发酵在畜牧业中的研究和应用，无论是基础理论方面还是研究手段都仍处在起步阶段，特别是对中药复方的发酵研发还很少，批量生产的发酵新药不多。现代发酵工艺面临一些关键性的问题，例如：中药自身体系的不明确性、中药所含成分的复杂性、中药发酵机理的研究还不深入、微生物生长特性的多样性与在中药发酵过程产生生物转化作用的不确定性等[13]。因此，现代发酵工艺技术还需进一步完善。首先是关于菌种的选育。根据李国红等[14]的试验结果，在经枯草芽孢杆菌发酵后，部分中药的发酵产物抗菌活性增加，而部分中药的发酵产物抗菌活性却有所降低，如何从自然界中选育、分离并纯化新的药用菌种，怎样根据药材自身特点选择合适的发酵菌种等都还有待进一步研究。其次关于多种微生物发酵工艺的研究应用、发酵中药如何进行筛选。例如王林等[15]在试验中发现向灵芝发酵液中加入黄芩、连翘、金银花后，样品生物量明显降低，而加入麻黄、莱菔子后灵芝的生物量明显高于对照组，说明向发酵液中加入不同中药及配比对灵芝生物量的影响差别很大，甚至会表现截然不同的效果。第三，确定最适发酵条件与终点，寻找发酵过程中科学的观测指标，建立中药筛选模型与多维评价体系，也是中药微生态发酵的技术难点之一[16]。中药微生态发酵技术是现代生物技术与传统中药工艺研究的有机结合，在新药、新兽药开发与中药现代化、国际化过程中占有重要地位[17]。微生物发酵中药作为抗生素的替代品成为目前研究的热点，但其仍处于发展阶段，很多方面有待深入研究[18]。

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