一种草鱼细菌病病原的分离鉴定

邓威

摘 要：天津市宁河县某淡水养殖池塘发生了一起草鱼细菌性疾病。患病草鱼出现腹部充血，腹腔积水和肝脏发白等症状。从患病草鱼肝脏中分离到PA001和PA002两个菌株，通过回感试验证明这两个菌株可能为引发该疾病的病原菌，经鉴定为铜绿假单胞菌。根据药物敏感性试验结果，采用口服氟苯尼考的方法进行治疗，取得了较好的效果。

关键词：铜绿假单胞菌；感染；草鱼；鉴定

中图分类号：S941 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.014

Identification and Isolation of Bacterial Pathogens from Bacterial Disease of Grass Carp

DENG Wei

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals， Tianjin 300221，China）

Abstract： An epizootic was discovered in grass carp （Ctenopharyngodonidellus） in earthen ponds in Ninghe. The diseased fish presented with hemorrhaging in the abdominal wall， ascites in the abdomen and pale liver. Strains named PA001 and PA002 were isolated from the moribund fish， and were identified as Pseudomonas aeruginosa according to biochemical tests. The pathogenicity of PA001 was confirmed by infectivity experiments. According to the result of antimicrobial susceptibility testing， florfenicol were used by oral administration， and the result showed that it was an effective measure to control the disease.

Key words： Pseudomonas aeruginosa； infection； grass carp； identification

假单胞菌是鱼类“赤皮病”的病原菌，该病对淡水养殖鱼类危害严重，常引起较大的经济损失[1]。在假单胞菌属之中，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、绿针假单胞菌和变形假单胞菌都能导致鱼类的病害发生[2-5]。然而，有关铜绿假单胞菌能引发鱼类疾病的报道却很少见，尽管其常作为一种人类病原被报道。本研究报道了一例由铜绿假单胞菌引发的草鱼疾病。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分离

2013年5月8日，10尾患病草鱼从天津市宁河县某养殖场送至本实验室进行诊断。通过镜检草鱼的鳃和体表，未发现大量的寄生虫。在无菌操作下，从濒死草鱼的肾脏、肝脏和脾脏取样，在LB培养平板上分离病原菌，28 °C培养24 h 后，选取优势菌落进一步分离纯化，分离得到两株优势菌株PA001和PA002。

1.2 细菌的鉴定

菌株PA001和PA002的形态、生理生化特性按文献[6]的方法进行鉴定。同时利用法国梅里埃公司的半自动细菌鉴定仪对菌株进行鉴定。

1.3 人工感染试验

试验草鱼由天津市换新良种场提供，共60尾，体长（12±2.1） cm。草鱼饲养于50 L的圆形塑料桶中，充气，每天按体质量的2%投喂膨化饲料，上下午各投喂1次。暂养2周，确认无病后，开始试验。将PA001用LB培养基培养，5 000 g离心集菌，用PBS洗涤3次后，用麦氏比浊法将菌液浓度调整为1.0×107 CFU·mL-1，腹腔注射草鱼0.2 mL，对照组注射同样剂量的PBS，连续观察2周。

1.4 药敏试验

28 °C培养过夜的PA001用PBS调整浓度至1×108 CFU·mL-1，取100 μL涂布于Mueller-Hinton琼脂平板，然后将药敏纸片（购于杭州微生物公司）贴在平板上，28 °C培养24 h 后测定抑菌直径，按照产品说明书判断敏感度。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

PA001和PA002呈现相同的生理生化特征，为革兰氏阴性杆菌，具有运动性，不产生孢子。在LB平板上28 °C培养48 h后，菌落成圆形，湿润，边缘整齐，不透明，淡黄色，菌落直径约为2～2.5 mm。同时，在血平板上，两株细菌都具有β溶血，其他生化反应与铜绿假单胞菌ATCC 27853株具有相同的结果（表1），因此，根据常规生理生化测试可初步判定为铜绿假单胞菌。

利用ATB鉴定系统对PA001和PA002进行鉴定，两株细菌显示完全相同的鉴定结果，都显示为铜绿假单胞菌（表2）。

2.2 人工感染试验

试验组草鱼在感染后第5天出现死亡，至14 d，累计死亡率为67%。人工感染后试验鱼表现为活动减弱，腹部充血，腹腔有积水，个别死亡鱼眼球突出。死鱼解剖检查，可见肝脏发白，同自然发病的症状基本相似，对照组不表现任何症状。从感染后的病鱼肝脏中再次分离细菌，用优势菌PA001-1再次感染草鱼，得到相同的结果。

2.3 药敏试验

根据菌株PA001对12种药物的药敏试验结果，该菌株对妥布霉素、四环素和氟苯尼考等3种抗生素敏感，对链霉素、氯霉素和庆大霉素等3种抗生素中度敏感，对诺氟沙星、氨苄青霉素、红霉素、罗红霉素、卡拉霉素和万古霉素等6种抗生素显示出耐药（表3）。

3 结论与讨论

草鱼是我国的四大家鱼之一，年产量达229.7万t[7]。然而，由于集约化程度和养殖密度的不断提高，草鱼病害也日渐增多。据报道，荧光假单胞菌[5]、柱状黄杆菌[8]、嗜水气单胞菌[9]、霍乱弧菌[6]和拟态弧菌[6]都曾引起草原细菌性病害的暴发。本试验中，铜绿假单胞菌从患病草鱼肝脏中被分离到，且通过攻毒试验证明其对草鱼的致病性，这说明铜绿假单胞菌是引起此次草鱼疾病的病原。然而，由于能对嗜水气单胞菌产生拮抗作用，为了控制嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，铜绿假单胞被作为一种益生素用于鲮鱼的养殖。由于铜绿假单胞菌对草鱼的致病性，它作为益生素使用的安全性应给予高度的重视。

此次疾病流行了1个月，导致了超过30%的草鱼死亡，根据药物敏感性的试验结果，利用口服氟苯尼考（每尾鱼25 mg·kg-1·d-1）的方法对草鱼进行治疗，3 d后病害得到控制，1周后草鱼停止死亡，这表明药物敏感性试验在治疗药物筛选过程中具有很强的实际意义。所以，在今后的生产实践中，应根据药物敏感性试验结果，做到科学合理地选择和使用药物。

参考文献：

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