软丝藻多糖的提取及理化性质分析

张泽峰，王晨旭，裴　蕊，祝肖梅，黄笑悦，陈　荫（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山　316022）

软丝藻多糖的提取及理化性质分析

张泽峰，王晨旭，裴蕊，祝肖梅，黄笑悦，陈荫
（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022）

采用热水提取的方法从舟山海域中的软丝藻中提取多糖成分，得率为25%。并对其多糖进行理化性质研究。研究结果表明，软丝藻多糖是硫酸酯化的酸性多糖，其硫酸基含量为26%，糖醛酸含量为23%，单糖组成及比率为Man：Rha：GlcUA：Glc：Xyl：Arb=2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0，分子量主要分布在210 kDa和10 kDa左右。

软丝藻；多糖；理化性质

软丝藻Ulothrix flacca Dillwyn.Thuret.，隶绿藻门Chlorophyta丝藻目Ulotrichales丝藻科Ulotrichaceae。分布于辽宁、山东、浙江、福建、广东等地沿海，生中、高潮带岩石上，盛期12月-翌年3月。浙江沿海主要分布海礁、嵊山、普陀山、渔山、南麂等地。藻体性寒，味咸；有清热解毒，利水渗湿，软坚散结之效，民间多有食用习惯［1］。绿藻为藻类中第一大门类，资源丰富，经济价值高，但是相比褐藻和红藻来说，开发利用仍相对滞后。研究表明，绿藻富含多种活性成分，特别是绿藻中的多糖具有抗辐射、抗凝血和抗病毒等多种生物活性［2-5］。本研究首次以舟山海域的软丝藻为研究对象，对其中多糖的含量及理化性质进行研究，为进一步开发海洋绿藻糖类资源，促进软丝藻的利用提供基础。

1　材料与方法

1.1材料

软丝藻藻体采自浙江舟山东极岛；甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（GaD）、木糖（Xy1）、阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc）标准品及胎牛血清白蛋白标准品为美国Sigma公司产品；高聚葡聚糖分子量标准品（P82）以及Shodex Ohpak SB-804HQ（8.0 mm× 300 mm）凝胶色谱柱为日本Shodex公司产品；其它试剂均为国产分析纯。高效液相色谱仪（LC-20AD，日本岛津公司）；紫外检测器（SPD-20A Shimadzu公司）；紫外可见分光光度计。

1.2方法

1.2.1软丝藻多糖的提取

采用热水提取的方法从软丝藻中提取多糖［6］。首先软丝藻藻体经过清洗烘干粉碎后过40目筛，经丙酮脱脂后40℃干燥。取一定量脱脂藻粉加20倍水（质量体积比），于100℃搅拌提取4 h后离心取上清液，重复提取3次后合并上清液，将上清液减压浓缩后加入4倍体积乙醇进行沉淀。静置过夜，离心收集沉淀。沉淀用水溶解，使用Sevag法除蛋白后透析除盐（截留分子量3500透析袋），浓度后冷冻干燥，得软丝藻多糖。

1.2.2软丝藻多糖的分子量分析

采用高效凝胶渗透色谱法分析软丝藻多糖的分子量范围［7］，色谱条件：色谱柱：Shodex Ohpak SB-806HQ凝胶色谱柱（300 mm×8.0 mm）；柱温：35℃；流动相：0.1 mol/L的Na2SO4；流速：0.5 mL/min；检测器：示差检测器（RID）。

标准曲线的制作：已知分子量的系列标准葡聚糖（2.5×103、6.1×103、9.6×103、21×103、22.8×103和47.1× 103u）。加流动相溶解，制成5 mg/mL的标准溶液。运用GPC分析软件以标准多糖分子量的对数（logMw）对保留时间（tR）作图，绘制标准曲线。

1.2.3硫酸基含量的测定［8］

样品完全酸水解后，采用离子色谱法测定多糖的硫酸基含量。色谱柱：SH-AC-1阴离子交换柱（苯乙烯和二乙烯基苯共聚物，4.6 mm×250 mm，13 μm）；3.6 mmol/L碳酸钠和4.5 mmol/L碳酸氢钠的混合液；流速：1.5 mL/min；电导检测器检测；抑制器电流：75 mA；柱温：35℃；柱压：5.5 MPa；背景电导：65 μs/cm；进样量：100 μL；采集时间：12 min。

硫酸根标准品溶液：精密量取硫酸钠溶液（硫酸根浓度20 μg/mL）8.0、6.0、4.0、3.0、1.0、0.25 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，制成16.0、12.0、8.0、6.0、2.0、0.5 μg/mL的标准品溶液。

1.2.4糖醛酸含量测定［9］

以葡萄糖醛酸作为标准品，采用咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量。

1.2.5软丝藻多糖的单糖组成分析［10］

本文采用完全酸水解后PMP柱前衍生高效液相色法分析其单糖组成。采用PMP衍生化方法，对等摩尔配制的单糖标准品和各多糖全水解后产物进行PMP衍生，然后进行液相色谱分析。色谱条件为：色谱柱：Agilent XDB-C18色谱柱；柱温：35℃；流动相：磷酸盐缓冲液（pH 6.7）/CH3CN（83：17，V：V）；流速：1.0 mL/min；检测器：DAD（245 nm）。

1.2.6红外光谱分析

采用KBr压片法，将约为0.1 mg多糖样品（减压干燥48 h）与适量干燥溴化钾粉末研磨混合均匀后，研制成透明薄片在Nicolet Nexus 470型红外光谱进行测定。红外光谱仪测定参数如下：背景扫描次数：32次；扫描范围为400～4 000 cm-1；分辨率：4.0 cm-1；检测器：DTGS。

2　结果

2.1软丝藻多糖的提取及相对分子量分析

软丝藻经过热水提取，Sevag法脱蛋白和透析脱盐后浓缩冻干得到软丝藻多糖，多糖呈白色絮状，相对于软丝藻干粉，软丝藻多糖的得率为25%。经过Sevag法脱蛋白重复3次后，软丝藻多糖的蛋白含量低于5%。通过HPGPC对软丝藻多糖的分子量分布进行分析表明（图1），软丝藻多糖根据分子量主要分为两大部分，且两部分分子量差别很大，分别为210 kDa和10 kDa。

图1　软丝藻多糖的高效凝胶渗透色谱图Fig.1　HPGPC chromatogram of polysaccharide from U.fiacca

2.2软丝藻多糖的硫酸基含量测定

通过离子色谱法对软丝藻多糖的硫酸基含量进行测定。通过对不同浓度的硫酸根标准液的出峰面积进行作图，得到标准曲线Y=2.054 e5+3.361 e5x，r=0.998 9。将样品的硫酸基出峰面积代入，换算得到软丝藻多糖的硫酸基含量为26.2%。说明软丝藻多糖和其他海洋绿藻来源的多糖一样，富含硫酸基取代。

2.3软丝藻多糖的糖醛酸含量测定

富含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等酸性糖也是海藻多糖的一大特性。对软丝藻多糖的糖醛酸含量测定表明，软丝藻多糖中也含有丰富的糖醛酸，含量约为23%，和其他绿藻相比含量较高。

2.4软丝藻多糖的单糖组成分析

图2　PMP柱前衍生高效液相色谱图（A、10种单糖标准品的PMP高效液相色谱图；B、软丝藻多糖的PMP高效液相色谱图）Fig.2　HPLC chromatogram of the PMP precolumn derivative（A.PMP pre-column derivative of 10 monosaccharide standards；B. polysaccharide from U.fiacca）

绿藻多糖的单糖组成较为复杂，采用PMP柱前衍生液相色谱法可以同时对多种不同性质的单糖进行测定。通过和标准图谱比对（图2），软丝藻多糖主要含有鼠李糖和葡萄糖醛酸，甘露糖和葡萄糖含量也比较丰富，另外还含有少量的阿拉伯糖和木糖。其各单糖组成的比率为Man：Rha：GlcUA：Glc：Xyl：Arb=2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0。不同来源的海藻多糖其单糖组成存在极大差异，而绿藻多糖相对褐藻和红藻来源的多糖其组成更加复杂。根据所含主要单糖组分，绿藻的水溶多糖可分为两大类：一类是主要由木糖、半乳糖和阿拉伯糖组成的“木糖-半乳糖-阿拉伯糖聚合物”（xylgalactoarabian），主要存在于松藻、蕨藻和刚毛藻等绿藻种类；另一类主要由葡萄糖醛酸、木糖和鼠李糖组成的“葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物”（glucuronoxylorhamnan），主要来源于中央顶管藻和石莼目的扁浒苔、石莼、礁膜和尾孢藻中。对丝藻目的绿藻中多糖的单糖组成还未进行系统的研究，从单糖组成上来看，软丝藻多糖富含鼠李糖和葡糖糖醛酸，所以更接近于石莼目的绿藻的单糖组成，但组成上存在一定的差异。其中的甘露糖和阿拉伯糖有可能是其细胞壁的成分，而葡萄糖可能为胞内的能源物质［11］。

2.5软丝藻多糖的红外光谱分析

采用溴化钾压片，测定软丝藻多糖红外光谱的特征。在软丝藻多糖的红外谱图中（图3）我们可以看到均含有-OH，-CH-，C-O-C等多糖特征吸收峰，另外还存在-COO-和S=O等特征官能团的吸收峰［12］，进一步证明软丝藻多糖为含有糖醛酸的硫酸化的多糖，与以上结果相吻合。红外光谱的各特征吸收峰归属见表1。

图3　软丝藻多糖的红外光谱Fig.3　IR of polysaccharide from U.fiacca

3　结论

本研究以舟山海域软丝藻为原料采用热水提取得到多糖组分。软丝藻多糖相对于干燥的藻体的提取率为25%。经高效凝胶渗透色谱HPGPC测得软丝藻多糖组分分布相对单一，主要含有两大组分，分子量分别为210 kDa、58.4 kDa和10 kDa。理化性质研究表明软丝藻多糖组分经脱蛋白后蛋白含量低于5%，硫酸基含量为26.2%，糖醛酸含量为23%，为富含糖醛酸的硫酸酯化多糖。液相色谱测定表明软丝藻多糖主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸组成，其次为甘露糖和葡萄糖，还含有木糖和阿拉伯糖。该结果表明软丝藻多糖具有独特理化性质的酸性硫酸多糖，具有深入研究开发的价值，而本文的理化性质研究为软丝藻多糖的结构和活性研究提供基础。

表1　软丝藻多糖组分红外光谱分析Tab.1　The IR spectra assignment of polysaccharide from Ulothrix fiacca

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Extraction and Physicochemical Analysis of Polysaccharides from Ulothrix fiacca

ZHANG Ze-feng，WANG Chen-xu，PEI Rui，et al
（Food and Medical School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

The polysaccharide was extracted from the marine green algae Ulothrix fiacca derived from sea region of Zhoushan.The Yields of the polysaccharide were about 25%.The analysis of the physicochemical characters showed that the polysaccharide was sulfated and acidic polysaccharide.The contents of sulfate ester and glucuronic acid were 26%and 23%respectively.The monosaccahride composition of the polysaccharide was Man，Rha，GlcUA，Glc，Xyl and Arb at the ratio of 2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0.The main distribution of the molecular weight of the polysaccharide was at 210 kDa and 10 kDa.

Ulothrix fiacca；polysaccharide；physicochemical character

R931.77

A

1008-830X（2015）04-0340-04

2015-04-24

浙江省自然科学基金项目（LQ14H300001）；浙江省教育厅科研基金项目（Y201328477）

张泽峰（1991-），男，山东吕梁人，研究方向：海洋药物.E-mail：18268732702@163.com

陈荫.E-mail：mojojo1984@163.com