捕捉胁迫对暗纹东方鲀肝脏非特异性免疫指标的影响

狄　瑜，徐　奕，李姗敏，闻海波，2（.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种与养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡　2408；2.南京农业大学，无锡渔业学院，江苏无锡　2408）

捕捉胁迫对暗纹东方鲀肝脏非特异性免疫指标的影响

狄瑜1，徐奕1，李姗敏1，闻海波1，2
（1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种与养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡214081；2.南京农业大学，无锡渔业学院，江苏无锡214081）

测定分析了暗纹东方鲀在持续、定量的捕捉胁迫条件下肝脏中非特异性免疫指标的变化。结果显示：暗纹东方鲀肝脏溶菌酶和AKP活力在处理的第1 d显著高于对照组水平（P＜0.05），在第2 d仍维持较高水平，第3 d酶活力显著降低，并最终恢复至对照组水平（P＞0.05）；肝脏中抗氧化酶SOD活性与溶菌酶、AKP变化趋势相似，而CAT活性在胁迫第1 d和第2 d逐步升高，至第3 d达到高峰并显著高于前两天和对照组（P＜0.05），第4 d显著下降并恢复至对照组水平（P＞0.05）。研究结果表明：暗纹东方鲀在适度的捕捉胁迫下，肝脏的非特异性免疫功能在初期虽受到了显著影响，但在后期能重新建立动态平衡，这可能是鱼体对特定强度操作胁迫一种主动适应。本结果将为暗纹东方鲀的康养殖管理提供一定的科学依据和指导。

暗纹东方鲀；捕捉胁迫；非特异性免疫

在现代化、集约型的水产养殖模式下，鱼类的生存和生长将不可避免将会受到物理、化学、生物及管理因子应激和胁迫［1］。国外，有关环境胁迫对鱼类的代谢、免疫及生殖内分泌等影响的研究报道较多，其主要涉及温度［2］、水质［3-4］、拥挤［5］等理化及生物因子。但随着水产养殖集约化水平的提高，有关管理因子胁迫方面的研究也越来越受到渔业科研工作者的普遍关注。在养殖生产过程中，运输、拉网、捕捉、露空、排污等管理操作有可能使鱼类产生胁迫和应激反应，从而影响其正常的呼吸、代谢、免疫及内分泌等生理功能，机体内主要表现为皮质醇升高，血糖和乳酸升高等指标变化；短期行为表现为躁动、狂游、食欲下降等现象，长期将影响鱼类的成活和生长。研究表明：随着鱼类受到胁迫频率的增加对其生长的影响也显著增大［6］。目前，国内已经有学者研究了不同操作胁迫对大黄鱼幼鱼Pseudosciaena crocea［7］、圆口铜鱼Coreius guichenoti［8］、云纹石斑鱼Epinehelus moara［9］、刀鲚Coilia ectenes［10］等名优养殖品种的生理、免疫功、神经及内分泌等机能的影响。随着水产养殖规模的扩大和集约化养殖程度不断提高，定量分析和评估应激因子对鱼类免疫系统的影响，对鱼类健康养殖和筛选减少鱼类应激反应方法、药物等均具有十分重要的指导意义。

暗纹东方鲀Takifugu obscurus俗称河豚，隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲈形总目、鲀形目、鲀科、东方鲀属，主要分布于渤海、东海、黄海及通海的江河中下游［11］，为江海洄游性鱼类，是我国著名的“长江三鲜”之一。自2000年突破其人工繁育技术以来，暗纹东方鲀已成为我国重要名优人工养殖品种之一。目前，关于其人工繁育、营养成分、生理等方面有较多研究报道，而有关捕捉操作胁迫对暗纹东方鲀非特异性免疫的影响研究尚未见报道。肝脏是暗纹东方鲀能量储存、排毒和性腺发育相关重要器官，还是营养价值丰富的食用部位［12］。本文测定了捕捉胁迫下暗纹东方鲀肝脏组织中溶菌酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力变化，探讨持续、定量的捕捉胁迫对肝脏非特异性免疫指标的影响，研究结果将为暗纹东方鲀的健康养殖管理提供相关依据和指导。

1　材料与方法

1.1实验鱼养殖

本研究所用暗纹东方鲀购自江苏中洋基团河豚养殖厂，实验前在10 t的水泥池中暂养1个月，投喂颗粒复合饲料。选择健康、无伤的个体用于实验。实验暗纹东方鲀的规格为体重（38.12±5.23）g、全长（14.32±1.85）cm。

1.2实验方法

实验在3 t的PVE缸中进行，实验用水为一级过滤海水。实验期间水温为22.3±0.5℃，每2日换水1次。每个缸随机选取河豚60尾，胁迫实验持续5 d。处理组每日定时用手抄网捕捉实验鱼并曝露在空气中15 s，每组设置3个重复，将不进行惊扰处理的河豚作为对照组。

1.3非特异性免疫指标的测定

分别在实验第0、1、2、3、4和5 d进行取样和酶活力，每个缸随机取6尾，用丁香酚进行快速麻醉，解剖后取肝脏进行溶菌酶、AKP、SOD和CAT活力测定，试剂盒购自南京建成生物研究所，按照说明书所示方法进行操作。

1.4数据处理

实验结果用平均值±标准误差（M±SE）表示。所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan法比较组间差异，当P＜0.05时被认为差异显著。

2　结果与分析

2.1捕捉胁迫对暗纹东方鲀溶菌酶活力的影响

在整个实验过程中，各组均未有死亡现象。胁迫处理对暗纹东方鲀肝脏中溶菌酶活力影响显著（图1）。胁迫组暗纹东方鲀肝脏中的溶菌酶活力迅速增加，在处理的第1和第2 d显著高于对照组水平（P＜0.05）；从第3 d起，溶菌酶活力开始降低并最终保持与对照组相似的水平。

2.2捕捉胁迫对暗纹东方鲀碱性磷酸酶活力的影响

胁迫处理对暗纹东方鲀肝脏中AKP活力的影响如图2所示。处理后，肝脏中AKP活力也随着处理时间的增加而迅速增高，在处理后第1和第2 d活力显著高于对照组（P＜0.05）；第3 d AKP活力逐渐降低，第4 d后活力与对照组无显著差异（P＞0.05）。

2.3捕捉胁迫对暗纹东方鲀超氧化物歧化酶活力的影响

胁迫处理后暗纹东方鲀的SOD活力变化如图3所示。结果表明，与AKP酶活力变化趋势相似，在处理初期暗纹东方鲀肝脏SOD活力呈现增高的趋势；并在处理后第1和第2 d显著高于对照组（P＜0.05），之后，逐渐降低并恢复至对照组水平。

2.4捕捉胁迫对暗纹东方鲀过氧化氢酶活力的影响

胁迫后暗纹东方鲀CAT活力的变化如图4所示。在胁迫处理组中，肝脏中CAT活力随着处理时间的增长而逐渐增高，并在处理后第3 d达到最高峰，其酶活力显著高于对照组（P＜0.05）；第4 d酶活力迅速下降并保持与对照组相似的水平（P＞0.05）。

图1　捕捉胁迫下暗纹东方鲀的溶菌酶活力变化Fig.1　Variation of lysozyme activity in T.obscures by handling stress treatment

图2　捕捉胁迫下暗纹东方鲀的碱性磷酸酶活力变化Fig.2　Variation of AKP activity in T. obscures by handling stress treatment

图3　捕捉胁迫下暗纹东方鲀的SOD活力变化Fig.3　Variation of SOD activity in T. obscures by handling stress treatment

图4　捕捉胁迫下暗纹东方鲀的CAT活力变化Fig.4　Variation of CAT activity in T.obscures by handling stress treatment

3　讨论

3.1捕捉胁迫对暗纹东方鲀溶菌酶和碱性磷酸酶活性的影响

溶菌酶是鱼体非特异性免疫的第一道防线，也是研究的最多的体液免疫因子之一，它主要由嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌，在粘液、血液和一些淋巴组织中广泛分布。碱性磷酸酶（AKP）是一种多功能水解酶，直接参与磷酸基团的转移和钙代谢，在骨生成及渗透调节中具有重要作用［13-14］，它也是动物溶酶体的重要组成部分，在免疫反应中发挥重要的作用［15］。

已有的研究表明：拥挤和操作胁迫能使鱼体免疫器官受损，抑制其细胞免疫和体液免疫功能，进而导致使机体抗病力下降；但鱼体对稳定的慢性胁迫环境有一定适应能力［16］。草鱼在慢性胁迫处理后溶菌酶活性先出现升高，达到峰值后逐渐下降，呈倒“U”型曲线，其血清杀菌活性随放养密度增加而大幅下降［17］；圆口铜鱼的血液和头肾AKP活性在操作应激前后各组间差异不显著［8］；而鲫鱼在长期拥挤胁迫条件下，高密度组的血液噬菌细胞活性一直维持在较低水平，且攻毒试验的死亡率显著下降［18］。本研究发现在捕捉胁迫处理后暗纹东方鲀肝脏中溶菌酶和碱性磷酸酶的活力逐渐增加，分别在第1 d就达到最高峰，之后逐渐降低，并最终恢复至对照组水平。推测暗纹东方鲀在受到该强度的捕捉胁迫后，机体处于急性应激状态，导致鱼体耗氧率升高、对能量的需求增加、代谢加速，在胁迫后短期内溶菌酶和碱性磷酸酶活性的升高将有助于提高鱼体代谢和能量供给，增加鱼体免疫力。

此外，边平江等［19］研究表明：低于12的盐度胁迫使暗纹东方鲀脾脏的溶菌酶和碱性磷酸酶显著升高，而后逐步降低恢复至对照组水平，对鱼体生长和存活无显著影响；在盐度高于18胁迫条件下，2种酶在第5 d达到最高，后降低并显著低于对照组水平，鱼体生长和存活也显著下降。这也表明无论是何种胁迫和应激，胁迫的程度高低对暗纹东方鲀的影响大小均存在较大的差异。本研究仅测定了部分免疫指标在捕捉胁迫下的变化，而对鱼体后期生长和存活未进行跟踪测定，该指标对暗纹东方鲀的健康科学养殖管理具有指导价值。

3.2捕捉胁迫对暗纹东方鲀肝脏抗氧化酶的影响

鱼类进行正常的新陈代谢活动时会产生自由基，是正常代谢活动的副产物，在通常情况下，机体内自由基的产生和抗氧化过程处于动态平衡中。当鱼体受到过度的应激和胁迫时，体内自由基会迅速增加并积累，而又大大超过机体清除能力，就会对体内的脂类、蛋白质和DNA造成损伤［20］，从而导致鱼体生长发育迟缓、抗病力下降等影响。鱼体抗氧化能力主要涉及SOD、CAT等酶类，其中SOD是超氧阴离子自由基（O2-）的清除剂，CAT能将过氧化氢（H2O2）转变为水［21］，它们能有效清除自由基体内的活性氧使细胞免受氧化损伤，在机体抗氧化及抵御应激反应中发挥重要作用。

不同类型的应激因子对不同鱼类、不同组织及不同抗氧化酶种类的影响均存在显著差异。尹飞等［22］研究表明：低盐度胁迫对银鲳幼鱼肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力表现出先升后显著下降，在处理120 h 后CAT活力酶活力均显著低于对照组；李茜［8］对圆口铜鱼头肾和血液中抗氧化酶活性在操作胁迫后变化分析发现，CAT在头肾组织和血液中变化明显，而头肾、血液AKP活性对操作胁迫反应不敏感。本研究结果表明：暗纹东方鲀在应激初期，肝脏中两种抗氧化酶均显著高于未胁迫组，但随着鱼体对捕捉操作的逐步适应，SOD和CAT分别在胁迫处理的第3 d、第4 d恢复至对照组水平，表明其抗氧化系统重新建立了平衡，这与孙鹏等［9］对云纹石斑鱼在操作胁迫后肝脏SOD和CAT的影响结果一致。边江平等［19］研究表明：同等规格的暗纹东方鲀在盐度高于18的化学因子胁迫下，SOD和CAT活力也呈现出先增加后降低的趋势，并最终保持与对照组相似的水平，但鱼体成活和生长显著低于对照组。MCCORMICK等［6］研究表明大西洋鲑在反复捕捉刺激下，生长率显著低于对照组。翁朝红等［7］对大黄鱼幼鱼的研究表明：长期的剧烈操作胁迫严重影响鱼体肝脾脏功能和机体免疫机能，肝脏的合成代谢也受到抑制，并显著抑制生长。本捕捉操作胁迫强度下虽然暗纹东方鲀的抗氧化能力得到重新恢复，但是否会对后期的生长发育及抗病产生影响仍需做进一步的研究。

在现代化、集约型的水产养殖模式下，养殖鱼类将不可避免会受到物理、化学、生物及管理因子应激。适度的应激和胁迫对增加鱼类的抗应激能力和抗病力具有积极作用，而过度的应激将导致生长发育迟缓、抵抗力下降，甚至死亡。因此，需要我们在渔业生产的每个环节制定合理的生产计划与操作规范，将操作应激控制在鱼类能承受的合理范围内是现代渔业健康养殖管理中值得深入研究的课题之一。

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Effects of Capture Stress on Non-specific Immune Parameters in Liver of Obscure Puffer Takifugu obscures

DI Yu，XU Yi，LI Shan-min，et al
（Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes，Ministry of Agriculture，Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi214081，China）

In the present study，enzyme activities of lysozyme，alkline phosphatase（AKP），superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）were analyzed to evaluate the effects of handling stress on non-specific immune parameters in liver of Obscure puffer Takifugu obscures.After capture stress，activities of lysozyme，AKP and SOD increased rapidly and peaked at the first two days，and then dropped to the level of control groups （P＜0.05）.CAT activities in treated groups also increased and peaked at the third day after treatment，then，its levels dropped to the levels of control groups（P＞0.05）.The results indicate that stress treatment would damage fish body by oxidate response，and non-specific immune system plays important role in stress response.The present study provides scientific information to healthy aquaculture and control of water quality in this species.

Takifugu obscures；capture stress；non-specific immunity

S917

A

1008-830X（2015）04-0314-04

2015-03-10

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（2013JBFR07）

狄瑜（1984-），女，江苏溧阳人，助理研究员，研究方向：水产养殖.E-mail：diy@ffrc.cn通讯作者：闻海波.E-mail：wenhb@ffrc.cn