关于溶菌酶含量测定方法的教学研究*

司鑫鑫，马燕燕，马卫兴

(江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005)

溶菌酶(lysozyme)是一种生物酶，属于生物药物，它是作用于微生物细胞壁的小分子碱性蛋白酶[1]，在生物体内广泛分布，具有抗细菌、病毒、真菌及肿瘤、促进组织修复、增强免疫力等多种生物活性作用，对组织无刺激性、无毒无害， 是一种性质优良的药用酶，广泛应用于医药领域，已制成多种溶菌酶制剂，如溶菌酶肠溶片、溶菌酶含片、溶菌酶口腔药膜、溶菌酶滴眼液，可用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等的治疗。溶菌酶含量测定是溶菌酶制剂质量标准中重要的检测项目，因此有必要从溶菌酶的性质和结构讨论溶菌酶的含量测定方法来源，为创新溶菌酶含量测定新方法提供创意。

1 吸光特性

溶菌酶是一种由多种氨基酸提供肽链结合的生物酶，其中含有芳香氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸等，芳香氨基酸具有紫外吸光特性，导致溶菌酶产生紫外光谱，利用这一吸光特性可建立紫外分光光度法测定溶菌酶含量的方法，如果在220～400 nm范围内进行紫外光谱扫描，会发现溶菌酶最大吸收波长在290 nm处，这样根据溶菌酶在290 nm处的吸光度与其浓度制备标准曲线，溶菌酶浓度在50～250 mg/L范围内与其吸光度呈现良好的线性关系，用于溶菌酶制剂含量测定，方法简单、结果更稳定，无需复杂仪器，检测费用较低，可操作性强[2]。

不同有机物具有不同的色谱行为，利用这一特性将含溶菌酶的样品处理后建立经过高效液相色谱分离-紫外检测或荧光检测测定溶菌酶的分析方法，所用色谱柱是反相苯基柱，以体积比为50:0.2:49.8的乙腈-三氟乙酸-水组成流动相A，以体积比为1:0.2:98.8的乙腈:三氟乙酸:水组成流动相B，进行进行梯度洗脱，通过保留时间定性、外标法定量，溶菌酶在5～60 mg/L浓度范围内线性关系良好，用于分离检测葡萄酒中溶菌酶含量，定量限为50 mg/L[3]。

2 配位特性

溶菌酶是一种由多种氨基酸通过肽键结合的生物酶，肽键具有配位特性，能与铜离子形成紫色配合物，这就是典型的双缩脲反应，双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，最大吸收波长位于540 nm，因此可利用溶菌酶的配位特性建立硫酸铜双缩脲反应可见分光光度测定溶菌酶的分析方法，用于溶菌酶的含量测定[4]。

3 还原特性

溶菌酶是一种有多种氨基酸通过肽链结合的生物酶，本质上也是一种蛋白质，其中包括有硫原子的半胱氨酸和胱氨酸，硫原子具有还原特性，因此溶菌酶具有还原特性。利用溶菌酶中含硫氨基酸的还原性，在碱性条件下将Cu2+还原成Cu+，Cu+与2分子的2,2-联奎琳-4,4-二甲酸二钠螯合生成在562 nm处具有最大吸收波长的紫色络合物，吸光度和溶菌酶浓度在广泛范围内有良好的线性关系，这就是著名的BCA法测溶菌酶原理，以标准牛血清白蛋白作为溶菌酶的标准，其浓度在0～2000 mg/L范围内与其吸光度呈现良好的线性关系，可用于溶菌酶制剂含量测定[5]。

4 离子特性

溶菌酶是一种蛋白质，是由许多氨基酸靠肽键组成的生物高分子，其氨基酸残基具有特定等电点，溶菌酶在较高pH下羧基解离成为溶菌酶阴离子，溶菌酶在较低pH下氨基质子化形成质子化的溶菌酶阳离子，依据这一离子性质可建立电泳技术定量检测溶菌酶的方法，即利用溶菌酶的离子特性借助电泳过程将溶菌酶在电泳凝胶上与其它蛋白分离开来，用红棕色的染料考马斯亮蓝G-250溶液在酸性条件中对溶菌酶所在位置进行离子缔合显色反应形成蓝色缔合物，用凝胶成像仪获取图像，在一定范围内蓝色随溶菌酶含量升高而加深，对应灰度值越大，用定量软件分析图像中溶菌酶条带灰度值，根据标准曲线的回归方程即可计算出溶菌酶含量，溶菌酶质量在0～3.5 μg范围内与电泳条带灰度之间呈现线性关系，适合于包含溶菌酶的多种蛋白质成分复杂体系样品分析[6]。

茜素紫是一种阴离子蒽醌类染料，能与质子化的溶菌酶阳离子形成离子缔合物引起强烈的共振光散射现象，在300～800 nm茜素紫或溶菌酶均无明显吸收峰，两者形成离子缔合物导致在420 nm处产生强烈的共振光散射信号，其强度随溶菌酶浓度的增加而增强，依此建立茜素紫共振光散射光谱测定溶菌酶含量的方法，溶菌酶标在2.0～30.0 mg/L范围内线性良好，用于测定人唾液中的溶菌酶含量，检出限为0.43 mg/L[7]。

pH 5.0时Cd-Te量子点的荧光发射波长是530 nm，而罗丹明B的荧光发射波长是550 nm，两者荧光光谱严重重叠，容易发生能量转移现象，因此在445 nm可见光激发下，当Cd-Te量子点与罗丹明B共存时Cd-Te量子点在530 nm处荧光强度下降而罗丹明B在550 nm处荧光强度上升，这是因为发生能量转移现象。当在此能量转移体系中再加入溶菌酶时，由于罗丹明B阳离子与溶菌酶阴离子发生了离子缔合导致罗丹明B在550 nm处荧光强度下降而Cd-Te量子点在530 nm处荧光强度上升，即溶菌酶的加入抑制了能量转移，依此建立Cd-Te量子点罗丹明B荧光共振能量转移测定溶菌酶含量的方法，溶菌酶的浓度与共振能量转移效率降低值在2×10-7～8×10-6mol/L范围内呈线性关系，检出限为2×10-8mol/L[8]。

5 吸附特性

溶菌酶具有可吸附性，可被多种材料吸附，如功能化碳纳米管、Fe3O4/壳聚糖纳米粒子等。基于溶菌酶的可吸附性，可借助原子力显微镜，其微悬臂可吸附溶菌酶，利用AFM激光束检测溶菌酶吸附前后的微悬臂形变程度，建立定量检测溶菌酶的方法，溶菌酶浓度在0.01～100 μg/L范围内其浓度的对数值与微悬臂偏转值呈良好的线性关系，检出限5.0 μg/L[9]。

6 免疫特性

将溶菌酶视作抗原，应用双抗体夹心法测定标本其含量，大致流程是，首先用溶菌酶抗体包被微孔板，向包被单抗的微孔中依次加入溶菌酶，再与碱性磷酸酶标记的溶菌酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经洗涤后加底物对硝基苯磷酸钠二乙醇胺显色，颜色深浅和样品中的溶菌酶含量呈正相关，依据这一免疫特性可开发出溶菌酶ELISA检测试剂盒[10]。

7 酶活特性

溶菌酶是一种可破坏β-1,4糖苷键、水解细菌细胞壁中黏多糖的碱性酶，利用这种酶活特性建立溶菌酶的含量测定方法。如阳离子铝酞菁是一种荧光染料，在610 nm光激发下产生发射波长位于683 nm，与阴离子黏多糖(肝素)发生聚集产生荧光猝灭现象，当溶菌酶存在并作为底物时，溶菌酶水解粘多糖，由于粘多糖减少导致体系荧光恢复，本质上是释放出了强荧光物质铝酞菁，这样开发出铝酞菁-黏多糖缔合物荧光探针测定溶菌酶含量的方法，该反应体系在683 nm处的荧光强度恢复值和溶菌酶浓度在0.2～2 mg/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.015 mg/L[11]。

8 裂解细菌特性

根据溶菌酶具有水解细菌细胞壁而使之裂解的特性，可设计多种基于酶活的含量测定法，一类是通过裂解细菌产生抑菌作用，包扩平板扩散法、琼脂糖火箭电泳法、比浊法等；另一类是通过裂解细菌从而释放出相关物质，如染料或荧光物质，包括比色测定法、荧光标记测定法等。

8.1 比浊法

以溶壁微球菌为底物，溶菌酶裂解底物导致细菌悬浊液变清，也就是浊度下降，实际测定中以吸光度代表浊度，建立比浊法测定溶菌酶含量，溶菌酶浓度0～50 mg/L内与490 nm处的吸光度降低值呈现线性关系，用于测定血清、尿液里的溶菌酶，灵敏度达到0.5 mg/L以下[12]。

8.2 平板扩散法

制备混有底物细菌的琼脂平板，加入溶菌酶，溶菌酶水解底物细菌可产生透明抑菌圈，测量抑菌圈直径，绘制抑菌圈对酶浓度的标准曲线，便可测定样品中溶菌酶的含量，该方法灵敏度为1.55 μg/mL[13]。

8.3 琼脂糖火箭电泳法

在平板扩散法基础上，结合电泳技术，使溶菌酶在电场中泳动，通过含有底物细菌的凝胶时，裂解细菌，形成透明火箭状溶菌峰，溶菌酶浓度5.0～100.0 mg/L范围内与溶菌峰的高度呈现线性关系，用于测定唾液样品中溶菌酶的含量，检出限为1.25 mg/L[14]。

8.4 比色测定法

将溶菌酶和染色小球菌共孵育，溶菌酶水解细胞壁而使之裂解释放出有色染料，用分光光度法比色测定所释放的有色染料，其颜色深浅与溶菌酶浓度呈正比关系，用于测定样品中溶菌酶含量[15]。

8.5 荧光标记测定法

以标记荧光素的溶壁微球菌细胞壁作为底物，溶菌酶水解溶壁微球菌，释放出具有荧光的荧光素，其荧光强度与溶菌酶活性呈正相关关系，可用于测定样品中的溶菌酶含量[16]。

9 结 语

溶菌酶具有多种特性，具有吸光特性、配位特性、还原特性、离子特性、吸附特性、免疫特性、酶活特性、裂解细菌特性等，通过对这些特性而建立溶菌酶分析方法的教学讨论，为未来设计溶菌酶分析新方法提供创意思路。