桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠心肌VEGF及nm23的干预*

张蕴慧（山东中医药大学，高血压国家中医临床研究基地，济南250014）

桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠心肌VEGF及nm23的干预*

张蕴慧
（山东中医药大学，高血压国家中医临床研究基地，济南250014）

［目的］观察桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠（SHR）心肌血管内皮生长因子（VEGF）及nm23的影响，探讨其对高血压病心肌血管生长促进因子、抑制因子的干预作用。［方法］SHR随机分为3组，空白对照组、吲哒帕胺西药对照组、桑仙降压颗粒组，以Wistar大鼠为正常对照，4周及8周后观察SHR心肌VEGF及nm23的表达。［结果］实验前正常对照组与空白对照组相比VEGF及nm23蛋白光密度值差异均无统计学意义。实验4、8周后相较空白对照组，桑仙降压颗粒组VEGF表达明显增多而nm23蛋白密度值显著减少。［结论］桑仙降压颗粒能增强VEGF的表达及降低nm23的蛋白密度值。

自发性高血压大鼠；桑仙降压颗粒；血管内皮生长因子；nm23

高血压是最常见的慢性病，也是心脑血管病最主要的危险因素之一，近年来，国家日益重视高血压的防治研究工作［1］。本研究以自发性高血压大鼠（SHR）为动物模型，通过对SHR心肌血管内皮生长因子（VEGF）及nm23的干预，以观测桑仙降压颗粒对高血压心肌血管生长促进因子、抑制因子的作用，以期为其能否对血管生长起到有益作用进行尝试。

1　材料与方法

1.1动物与分组4周龄Wistar大鼠，18只，雌雄各半，体质量210～250 g，由山东医科大学动物室提供［动物合格证号：SCXK（鲁）20090001］。4周龄SHR，42只，雌雄各半，体质量200～240 g，由中国医科院阜外心血管医院提供（医动字第01-108号）。以A标示正常对照组即Wistar大鼠组；SHR随机分为B、C、D组，B：SHR给予蒸馏水为空白对照组，C：SHR给予桑仙降压颗粒为实验组，D：SHR给予吲哒帕胺为西药对照组；观测时相点：0组的观测时间为Wistar大鼠、SHR4周龄；1、2的观测时间为Wistar大鼠、SHR给药后4周、8周。在3个观测时间点分别观测，随机分组为A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2。每组6只。

1.2药物桑仙降压颗粒组方有桑寄生、淫羊藿、丹参、川芎等，由山东中医药大学中药制剂室按正交实验法优选工艺制成，每克含生药6 g，临用前加蒸馏水稀释成含生药0.8 g/mL的药液。吲哒帕胺片每粒2.5 mg，由天津力生制药股份有限公司提供，实验前加生理盐水适量，制备成浓度0.025 g/L混悬液，置4℃冰箱保存备用，使用前振荡，充分摇匀。

1.3试剂Anti-Nm23-H1为北京博奥森生物技术有限公司产品；VEGF免疫组化染色试剂盒、生物素化山羊抗兔IgG，链霉亲和素2生物素（SABC）和DAB显色剂，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.4实验仪器METTLER AE20型电子分析天平，海特勒托利多（上海）仪器有限公司提供；康乐电热恒温水浴槽，上海医疗器件七厂提供；光学显微镜，由山东省中医院病理科提供。

2　方法及检测

2.1制备用戊巴比妥钠（40 mg/kg）体质量腹腔注射，麻醉后立即经腹主动脉注入4℃生理盐水，切开下腔静脉放血，待冲洗液干净无色后，立即开胸，快速分离、摘取心脏，置入4℃生理盐水中快速冲洗3次。

2.2VEGF蛋白含量检测采用免疫组化SP法。结果判断：参照AXIOTIS等标准［2］，由两位病理医生采用盲法（独立检测）在高倍镜（×400）下读片。每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共纪录1 000个细胞，综合染色强度和阳性细胞数量进行判定。1）按切片中细胞着色深浅评分：0分为细胞无显色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：1分为＜25%；2分为≥25%且≤50%；3分为＞50%且≤75%；4分为＞75%。取1）、2）两项评分的乘积作为总积分：0～3分为（-）；＞3分且≤6分为（+）；＞6分且≤9分为（++）；＞9分（+++）。染色结果由两名病理医师采取双盲法评定。（-/+）为低表达，（++/+++）为高表达。

2.3nm23蛋白的表达采用免疫组化SP法。每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共纪录1 000个细胞。其结果判定同VEGF。

2.4统计学分析方法数据采用SPSS18.0进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较若方差齐采用LSD法，两两比较若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　实验结果

3.1VEGF蛋白含量检测实验前，空白对照组VEGF蛋白光密度值与正常对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。实验4周，与正常对照组相比，空白对照组VEGF蛋白光密度值降低（P＜0.05）；与空白对照组比较，实验组与西药对照组VEGF蛋白光密度值均有显著升高（P＜0.05）。实验8周，空白对照组大鼠VEGF蛋白光密度值明显降低，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白对照组比较，实验组与西药对照组VEGF蛋白光密度值均非常显著升高（P＜0.01）；实验组与西药对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1、表2、图1。

3.2nm23蛋白表达实验前，空白对照组大鼠nm23蛋白光密度值与正常对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。实验4周，空白对照组大鼠nm23蛋白光密度值升高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白对照组比较，西药对照组与实验组nm23蛋白光密度值均有降低，且差异有统计学意义（P＜0.01）。实验8周，空白对照组大鼠nm23蛋白光密度值明显升高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白对照组比较，西药对照组与实验组nm23蛋白光密度值均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；西药对照组与实验组相比差异无统计意义（P＞0.05）。结果见图2、表3、表4。

表1　实验前正常对照组和空白对照组VEGF蛋白光密度值积分比较分

表1　实验前正常对照组和空白对照组VEGF蛋白光密度值积分比较分

注：与正常对照组比较，*P＞0.05。

组别正常对照组空白对照组n 6 6 VEGF蛋白光密度表达积分7.25±0.55* 7.18±0.48*

表2　实验4周、8周后各组VEGF蛋白光密度值积分比较（分

表2　实验4周、8周后各组VEGF蛋白光密度值积分比较（分

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组相比，△△P＜0.01，△P＜0.05；与西药对照组相比#P＞0.05。

组别正常对照组空白对照组西药对照组实验组n 6 6 6 6实验4周后7.19±0.49 5.11±0.33* 6.15±0.29△6.11±0.51△实验8周后6.33±0.34 3.29±0.65** 4.32±0.45△△5.57±0.38△△#

图1　VEGF蛋白表达（免疫组化染色×400）

4　讨论

微血管损害存在于各期高血压［3］，在高血压及心、脑、肾靶器官病变的发生、发展和转归中发挥重要作用。因此，改善微血管损害应成为防治高血压的有效措施［4］。促进血管新生是改善微血管损害的有效途径，血管新生是指原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程［5-7］。血管内皮细胞的增殖是血管新生发生最基本和最重要的环节，内皮细胞的迁移是血管生成的重要步骤［8-11］。VEGF是诱导微血管形成作用最强、特异性最高的血管生长因子［12］，能特异性地直接作用血管内皮细胞，引起血管内皮细胞增殖，促进血管形成，其作为血管内皮细胞的特异性有丝分裂刺激因子，与Flt/Flk两个受体之间发生高度亲和作用，在它们发生结合以后便表现出强大的刺激血管新生的作用，诱导血管内皮细胞的增殖、分化与迁徙，促进微血管形成。VEGF是目前唯一被证明对血管生成严格特异性的血管内皮生长因子，它在血管形成的起始、发展以及成熟过程中起到积极作用，是一种血管生成标志物［13-17］。

nm23基因是1988年美国Steeg等［18］用消减杂交分离的方法从小鼠黑色素瘤K-1735细胞系中发现并分离出的肿瘤转移抑制基因。随着进一步研究，发现nm23表达与VFGF表达明显呈负相关，nm23低表达可能促进VFGF高表达，导致肿瘤血管生成［19］。由于nm23与VFGF在促进微血管生成方面具有协同作用，因此将nm23表达作为抑制因子引入到对心肌血管生长的观测中。

图2　nm23蛋白表达（免疫组化染色×400）

表3　实验前正常对照组和空白对照组nm23蛋白光密度值积分比较分

表3　实验前正常对照组和空白对照组nm23蛋白光密度值积分比较分

注：与正常对照组比较，*P＞0.05。

组别正常对照组空白对照组n 6 6 nm23蛋白光密度表达积分4.02±0.81* 4.45±1.01*

表4　实验4周、8周各组nm23蛋白光密度值积分比较分

表4　实验4周、8周各组nm23蛋白光密度值积分比较分

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与空白对照组相比，△△P＜0.01；与西药对照组相比，#P＞0.05。

组别正常对照组空白对照组西药对照组实验组n 6 6 6 6实验4周后3.82±0.54 6.87±0.65** 3.67±0.44△△3.71±1.13△△实验8周后3.95±0.38 7.01±1.32** 4.85±0.58△△4.69±0.70△△#

研究表明桑仙降压颗粒增加SHR心肌微血管密度，具有保护微血管的作用［20］。本研究以VEGF及nm23为观测点，结果表明：实验4周、8周后，与正常对照组相比，空白对照组VEGF蛋白密度值降低，而nm23蛋白密度值升高；但与空白对照组相比，实验组与西药对照组VEGF蛋白光密度值均明显增加，nm23蛋白表达却明显降低，从而提示桑仙降压颗粒能有效增加血管生长促进因子表达、降低抑制因子表达，可能对减少高血压引起的微血管损害起到有益作用，其是否还可通过影响其他血管生成促进因子、抑制因子进而减轻高血压及其靶器官微血管损害有待进一步研究。

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Intervention of Sangxian Jiangya granule on VEGF and NM23 of spontaneously hypertensive rats

ZHANG Yun-hui
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

［Objective］To observe effect of Sangxian Jiangya granule on myocardial vascular endothelial growth factor（VEGF）and nm23，and to discuss the intervention of Sangxian Jiangya granule on the growth and inhibition factor of vascular endothelial cell.［Methods］Spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 3 groups: control group，indapamide control group of Western medicine，Sangxian Jiangya group，using Wistar rats as normal control group.After 4 and 8 weeks，myocardial VEGF expression of nm23 was observed.［Results］Compared with the blank control group，in Sangxian Jiangya group the VEGF protein density was markedly increased and nm23 protein density was significantly decreased.［Conclusion］SangxianJiangya granulecould enhanceVEGFexpression and decrease nm23 protein density value.

spontaneously hypertensive rats；Sangxian Jiangya granule；VEGF；nm23

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0152-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.07

山东省中青年科学家基金课题（2006 BS03047）；山东省自然基金课题（30873241）；泰山学者资金资助项目。

张蕴慧（1972-），副教授，硕士研究生导师，研究方向为中医药治疗心血管疾病的临床与实验研究。

（2015-02-01）