齿叶白鹃梅叶中黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究*

李古月，刘佳鑫，才　谦（1.中国医科大学附属第一医院，沈阳110000；2.中国医科大学药学院，沈阳110000；.辽宁中医药大学药学院，大连116600）

齿叶白鹃梅叶中黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究*

李古月1，2，刘佳鑫1，2，才谦3
（1.中国医科大学附属第一医院，沈阳110000；2.中国医科大学药学院，沈阳110000；3.辽宁中医药大学药学院，大连116600）

［目的］研究齿叶白鹃梅叶中分离得到的黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。［方法］以96微孔板法测定α-葡萄糖苷酶抑制作用。［结果］齿叶白鹃梅叶中多个黄酮类化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中木犀草素，木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷，芹菜素，芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷，槲皮素，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于阿卡波糖。［结论］黄酮类化合物可能是齿叶白鹃梅叶具有降糖作用的物质基础。

齿叶白鹃梅叶；黄酮；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S.Moore.），是蔷薇科绣线菊亚科白鹃梅属植物［1］。白鹃梅属分为白鹃梅和齿叶白鹃梅两个种，其中白鹃梅主要生长在中国的江苏省、浙江省、安徽省一带，以其根皮、树皮入药，多用于腰膝酸痛的治疗［2］。齿叶白鹃梅主要生长在辽宁省凌源市、喀左县及河北省一带。其嫩叶可食用，民间多用其预防和治疗糖尿病。本课题组研究发现齿叶白鹃梅叶的乙醇和水提取物确有改善小鼠耐糖量及降血糖作用［3］。通过对其化学成分进行研究，本课题组分离得到多个以芹菜素、木犀草素、槲皮素为苷元的黄酮类化合物，如芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷等十几个化合物［4-5］。为探讨齿叶白鹃梅的降糖作用是否与其中含有的黄酮类化合物有关，阐明该植物降血糖的物质基础，本文将主要观察齿叶白鹃梅叶中分离得到的这些黄酮单体对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，为解释其降糖机制、进而为将其开发成为新的植物降糖药奠定基础。

1　材料

1.1仪器UV-3100型紫外可见分光光度计（日本东芝公司）；CP225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（巩义予华仪器有限责任公司）；酶标仪（上海医科大学仪器厂）；BS210S电子天平（Sartorius）。

1.2药品与试剂齿叶白鹃梅叶采自辽宁省凌源市，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S.）的叶子；α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，Sigma公司）；对-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG；0215868010，上海宝曼生物科技有限公司）；对硝基苯酚（PNP；20040322，湘中地质实验研究所）；阿卡波糖（110105，拜耳医药保健有限公司）；碳酸钠（Na2CO3），北京化学试剂公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

2　实验方法

2.1化学成分的分离和结构鉴定齿叶白鹃梅叶（2.5kg）用70%乙醇提取2次，每次10倍量，提取2h，合并提取液，减压回收溶剂，浸膏用蒸馏水稀释后，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物54 g和正丁醇萃取物144 g。正丁醇萃取物采用硅胶柱色谱进行分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，共得到6个组分。组分5再经硅胶柱色谱和Sephadex LH-20柱色谱进行分离，分别得到化合物1、2、3；组分6采用硅胶柱色谱进行分离，甲醇-乙酸乙酯梯度洗脱，并经重结晶，分别得到化合物4 和5；乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱进行分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，共得到18个组分，组分4、6、17再分别经硅胶柱色谱分离，采用氯仿-甲醇梯度洗脱，再结合反相硅胶进行分离，分别得到化合物6、7、8、9、10。根据分离得到的化合物的理化性质并结合波谱数据，确定化合物的结构。

2.2标准曲线的制作根据采用的反应体系，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）配制1 000 μmol/L PNP溶液，稀释成250、200、150、100、50、25、10、5、2、0 μmol/L。分别取不同浓度的PNP溶液各200 μL，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液5 mL，混匀，在405 nm下测定A值。以吸光度值为纵坐标（Y），PNP浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。

2.3α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定根据Tremblay等［6-8］的方法，即以PNPG为底物，0.1 mol/L Na2CO3为终止液，于405 nm处比色测定。活力单位定义为：在37℃、pH6.8的条件下，1 min内水解PNPG释放1 μmol PNP所需的酶量。抑制活性即为相同条件下降低1个酶活力单位所需的化合物的量。

抑制百分比=100%×（总酶活-残余酶活）/总酶活。

2.4统计分析按照抑制率（%）=［1-（样品A实验组-样品A空白组）/（对照A实验组-对照A空白组）］×100%计算抑制率，并用OriginPro 7.5 SR1软件计算半数抑制浓度（IC50）值。

3　结果

3.1分 离得到的化合物结构见图1，名称见表1。

图1　齿叶白鹃梅叶中分离得到的化合物的结构图

3.2标准曲线以PNP浓度（X）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程:= 5.654 7X+0.028 1（r=0.999 2），结果表明线性关系良好，线性浓度范围为：0～250 μmol/L。

3.3样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响按照上述反应体系，加入不同体积的各样品溶液，测得最大抑制活性及IC50值［9-12］，结果见表2、图2。

表1　齿叶白鹃梅叶中分离得到的化合物

结果表明，从齿叶白鹃梅叶中分离得到的黄酮单体均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷6个化合物的抑制率均大于阳性对照药阿卡波糖。

表2　齿叶白鹃梅叶中各黄酮单体对α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=5）

图2　齿叶白鹃梅叶中黄酮单体对α-葡萄糖苷酶的抑制率

4　讨论

在全球范围内，糖尿病已成为日益严重危害人类健康的疾病，为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的“第三号杀手”［13-14］。而糖尿病患者的首要目标是控制餐后血糖值，避免超高血糖值的出现。食物中的多糖复合物可由淀粉酶水解为糊精和寡糖，在肠吸收和进入血液循环之前进一步由α-葡萄糖苷酶水解，从低聚糖底物的非还原端切开α-1，4-糖苷键，释放出葡萄糖［15-18］，α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制存在于小肠黏膜微绒毛膜表面的麦芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能够延缓或减少肠道对碳水化合物消化与吸收，具有降低餐后血糖的作用［19-20］。

通过检测从齿叶白鹃梅叶中分离得到的黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，发现这10个黄酮单体均有表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，部分化合物的抑制率均大于阳性对照药阿卡波糖［21］，结果表明，黄酮类化合物可能是齿叶白鹃梅叶具有降血糖作用的物质基础。

从齿叶白鹃梅叶中分离得到的10个黄酮单体中，有3个是黄酮苷元，7个是黄酮苷，通过比较这两类黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，发现黄酮苷元的抑制活性普遍高于黄酮。提示苷元成苷后，酶抑制活性会有不同程度的降低，3个苷元的酶抑制活性由强到弱顺序分别为：芹菜素＞木犀草素＞槲皮素，具体原因还需进一步深入研究。

本课题组对齿叶白鹃梅的化学成分和药理作用进行了研究，通过糖耐量和降血糖实验证明了其确有降糖作用，通过化学成分的分离明确了其中含有的主要化学成分类型，并建立了含量测定方法。本文通过从该植物中分离得到的多个黄酮类成分的α-葡萄糖苷酶作用的研究，初步明确了该植物降糖作用可能与其中的黄酮类化合物抑制α-葡萄糖苷酶有关，黄酮类化合物可能是其降血糖的物质基础。这些研究为齿叶白鹃梅的深入研究和开发奠定了基础。

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Inhibitory activity of flavonoids isolated from Exochorda serratifolia S.Moore.on α-glucosidase

LI Gu-yue1，2，LIU Jia-xin1，2，CAI Qian3
（1.The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110000，China；2.Pharmacy College of China Medical University，Shenyang 110000，China；3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

［Objective］To investigate the inhibitory activity of flavonoids isolated from Exochorda serratifolia S. Moore.leaves on α-glucosidase.［Methods］Inhibitory activity of α-glucosidase was screened by the 96-microplatebased method.［Results］The flavonoids showed inhibitory activity on α-glucosidase.Among them，luteolin，luteolin-7-O-β-D-neospheroside，apigenin，apigenin-7-O-β-D-neospheroside，quercetin，quercetin-3-O-β-D-glucoside showed stronger inhibitory activity than acarbose.［Conclusion］Flavonoids may be the substances basis of Exochorda serratifolia S.Moore.leaves with inhibitory activity of α-glucosidase.

Exochorda serratifolia S.Moore.；flavonoids；α-glucosidase；inhibitory activity

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0165-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.10

国家自然科学基金项目（81202919）。

李古月（1984-），女，药师，从事临床制剂指导工作。

（2014-02-05）