阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织形态学及血清IL-17、TNF-α和IFN-γ表达的影响*

丁伟伟，杨　程，徐增梅，童佳兵，陆　梅，童祥丽，李泽庚（.安徽中医药大学，合肥3003；.安徽中医药大学第一附属医院，合肥30038）

·实验研究·

阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织形态学及血清IL-17、TNF-α和IFN-γ表达的影响*

丁伟伟1，杨程2，徐增梅1，童佳兵2，陆梅1，童祥丽1，李泽庚1
（1.安徽中医药大学，合肥230031；2.安徽中医药大学第一附属医院，合肥230038）

［目的］探讨阳和平喘颗粒（YHPC）对哮喘大鼠肺组织形态学及血清白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）表达的影响，从抗炎和提高免疫功能方面探讨阳和平喘颗粒治疗支气管哮喘的作用机制。［方法］SD大鼠90只随机分为6组，每组15只，分别为正常组（N组）、模型组（M组）、阳和平喘颗粒低、中、高剂量治疗组（YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H组）和地塞米松组（DXM组）。其中，M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM组均采用国际通用的方法，即卵蛋白（OVA）腹腔注射致敏及联合雾化吸入激发建立哮喘模型，同时，应用氢化可的松进行腹腔注射以复制肾阳虚模型，N组使用生理盐水作为对照。苏木精-伊红（HE）染色检测各组大鼠肺组织病理学变化，酶联免疫吸附法（ELISA法）检测各组大鼠血清IL-17、TNF-α和IFN-γ表达水平的变化。［结果］与N组相比，M组大鼠血清IL-17、TNF-α显著升高（P＜0.01），IFN-γ明显降低（P＜0.01）；与M组相比，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM组大鼠血清IL-17、TNF-α均发生下降（P＜0.01），IFN-γ则明显上升（P＜0.01）；与DXM组相比，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H组对IL-17和TNF-α的作用效果小于DXM（P＜0.01），而对IFN-γ的作用效果强于DXM（P＜0.01）。［结论］阳和平喘颗粒可通过抗炎及增强机体免疫力而达到支气管哮喘标本兼治的目的。

支气管哮喘；阳和平喘颗粒；地塞米松；白介素-17；肿瘤坏死因子-α；干拢素-γ

支气管哮喘是由多种细胞（嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、支气管上皮细胞等）和细胞因子参与介导的气道慢性变应性疾病，近年来其发病率和病死率呈上升趋势［1-3］。阳和平喘颗粒（YHPC）由阳和汤和平喘汤综合化裁而成，具有温阳纳气、宣肺平喘、标本兼治之功效，本研究拟通过观察阳和平喘颗粒对肾阳虚型哮喘大鼠血清白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的影响，分别从抗炎和增强机体免疫功能的角度探讨阳和平喘颗粒治疗支气管哮喘的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠90只，清洁级，体质量（200±20）g，由安徽医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：皖医实动准字01号。

1.2药物及试剂阳和平喘颗粒由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，批号20120511；地塞米松、卵蛋白（OVA），购自Sigma公司；IL-17、TNF-α和IFN-γ酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，购自R&D公司。

1.3模型复制90只雄性SD大鼠按照随机数字表法随机分为6组，每组15只，分别为正常组（N组）、哮喘模型组（M组）、阳和平喘颗粒低、中、高剂量组（YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H组）和地塞米松组（DXM组），适应性喂养7 d后进行实验。参考有关文献［4］并加以改进，应用OVA致敏和激发的方法进行哮喘模型的复制，其中M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM组分别在实验的第1天和第7天分两点进行腹腔注射OVA1mL（含OVA10mg，氢氧化铝20 mg），每点0.5 mL，实验第15天开始将致敏大鼠置于雾化箱中，以恒压400 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）雾化吸入1%OVA 15 min，每日1次，持续14 d，而N组在致敏和激发阶段均使用生理盐水作为对照。同时，在哮喘模型的基础上分别于实验第14、16、18、19、22、26、28天按每只1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、4.0、8.0 mL腹腔分两点注射浓度为1 mg/mL的氢化可的松，直至出现呼吸频率加快、气急、咳嗽、静卧少动、便溏、毛发倒伏、舌色发青、畏冷等症状，即为造模成功。同时，N组在致敏、激发、肾阳虚模型复制阶段均使用生理盐水作为对照。

1.4给药方法实验第28天开始，YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H组大鼠分别按1.62、3.24和6.28 g/kg的剂量标准进行灌胃给药，DXM组按0.5 mg/kg的标准进行灌胃给药，每日1次，连续给药2周。同时，N组和M组以等量的生理盐水进行灌胃2周，处死动物前12 h停止给药并禁食。

1.5标本采集各组大鼠分别给予3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血3 mL，3 000 r/min离心10 min，留取上清液，-80℃保存备用。同时，常规留取肺组织进行甲醛固定。

2　指标观测

2.1证候学观察M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H 和DXM组大鼠先后出现呼吸加快、点头呼吸、咳嗽、毛发倒伏、口唇发绀、畏寒、缩聚成团、站立不稳、精神萎靡、便溏等症状，同时，伴有各组均有少数不等的大鼠死亡。N组则无上述症状，无死亡现象。

2.2实验室指标检测

2.2.1肺组织病理学表现常规留取肺组织后，应用10%甲醛溶液进行固定、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红（HE）染色。光学显微镜下随机观察5个气道横切面图像，比较分析各组大鼠肺组织病理学改变情况。

2.2.2血清IL-17、TNF-α和IFN-γ含量检测将保存于-80℃血清进行解冻处理，按ELISA试剂盒操作说明进行IL-17、TNF-α和IFN-γ检测，并进行统计分析。

2.3统计方法应用SPSS18.0统计软件分析，每组数据均重复3次，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1肺组织病理学表现HE染色结果显示，N组：气道壁结构完整、轮廓清晰，无充血、水肿、渗出等表现，小气道及血管周围未见炎性细胞浸润，无支气管柱状上皮细胞和杯状细胞增生（图1-A）；M组：支气管壁皱襞增多、断裂，支气管上皮细胞增生明显，基底膜下平滑肌增厚，管腔明显狭窄变形，小气道及血管周围有大量炎症性细胞浸润，其中以嗜酸性粒细胞片状浸润为主，支气管柱状上皮细胞和杯状细胞增生明显，气道内黏液分泌增多（图1-B）。YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM组：小气道及血管周围少量炎性细胞浸润，但无M组显著（图1-C、D、E、F）。

图1　肺组织病理学表现（HE染色×200）

3.2血清IL-17、TNF-α和IFN-γ含量变化见表1。

表1　阳和平喘颗粒对大鼠血清IL-17、TNF-α和IFN-γ的影响ng/L

从表1可以看出，与N组相比，M组IL-17、TNF-α显著升高（P＜0.01），IFN-γ明显降低（P＜0.01）；与M组相比，YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H 组IL-17、TNF-α均发生下降（P＜0.01），IFN-γ显著上升（P＜0.01），且具有一定的剂量依赖效应；与DXM组相比，YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H组IL-17、TNF-α改变程度小于DXM组（P＜0.01），而IFN-γ的变化程度则强于DXM组（P＜0.01）。

4　讨论

支气管哮喘是呼吸系统的常见病、多发病，全世界约有3亿人患有支气管哮喘，中国至少有2 000万支气管哮喘患者，并且近年来其发病率和病死率呈上升趋势［5］。中医学将其归属于“哮病”、“喘证”范畴，并将病因病机归纳为肺不能布散津液，脾不能运输精微，肾不能蒸化水液，认为痰饮伏肺是其标，肾气不足是其本。刘恩顺等［6］通过对支气管哮喘中医证候及证候要素的流行病学调查分析表明，在辨证论治的基础上针对不同的证候特点来遣方用药，有利于提高支气管哮喘的防治水平。张蕴卓等［7］通过研究分析咳喘方治疗痰热郁肺型支气管哮喘的临床疗效发现，咳喘方的治疗效果和泼尼松相当（P＜0.05），表明中医药对支气管哮喘有着肯定的临床疗效。阳和平喘颗粒是由阳和汤和平喘汤综合化裁而成，立足于“哮喘以痰饮内伏为标，肾气不足为本”，方中炙麻黄宣肺平喘，鹿角胶、淫羊藿温肾纳气定喘，当归温通调营平喘，肺肾同治，温宣相宜，补散结合，具有显著的临床疗效［8］。

现代医学研究表明，Th1/Th2细胞功能失衡是支气管哮喘发病的关键机制，主要表现为Th1型细胞功能低下，Th2型细胞功能亢进［9-11］。IL-17主要由激活的CD4+和CD8+T细胞所产生，属Th2型细胞因子，具有强烈的致炎性，可通过多种方式、多种途径参与支气管哮喘的发生发展。IL-17可诱导支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞及巨噬细胞释放促炎症性细胞因子白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）、趋化因子CXCL-1和CXCL-8等，进而导致炎症反应和组织损害［12-14］。龚臣等［15］研究表明，支气管哮喘患者外周血中IL-17的水平显著高于正常人，且与嗜酸性粒细胞计数呈中度正相关，提示IL-17参与了支气管哮喘的发病。Candrian等［16］研究表明，IL-17在支气管哮喘发生和急性加重时会显著升高，促进肺部嗜酸性粒细胞聚集，导致气道高反应性及气道重塑。

TNF-α是由多种细胞分泌的前炎症性细胞因子，亦属于Th2型细胞因子，具有广泛的生物学功能。研究表明，TNF-α可促进支气管内致敏活性物质的释放，进而诱发支气管哮喘的发生［17-18］。Puthothu等［19］研究发现，吸入或者静脉注射TNF-α可导致气道阻力延迟性增高和气道高反应性，同时伴有大量嗜酸性粒细胞浸润，表明TNF-α可能在启动支气管哮喘中发挥了关键作用。

IFN-γ是由Th1细胞分泌的细胞因子，具有抗炎抗病毒、增强机体免疫力等生物学活性。申鸿等［20］研究表明，与健康对照组相比，支气管哮喘患者血清IFN-γ水平显著降低，而白介素-4（IL-4）、IgE的水平则显著升高，两者呈负相关（r=-0.49、r=-0.52），提示IFN-γ、IL-4和IgE对患者病情的判断及治疗具有重要的临床意义。过红霞［21］通过使用IFN-γ佐治小儿支气管哮喘的研究发现，IFN-γ具有显著的临床疗效，值得临床推广应用。

本研究发现，低、中、高剂量的阳和平喘颗粒均可降低肾阳虚型哮喘大鼠血清IL-17、TNF-α的含量，同时提高IFN-γ的含量，表明阳和平喘颗粒可通过抗炎及提高机体免疫力进而达到治疗支气管哮喘的效果。同时，研究还发现，阳和平喘颗粒降低IL-17、TNF-α的程度低于地塞米松，而提高IFN-γ水平的程度强于地塞米松，推测阳和平喘颗粒主要通过增强机体免疫功能进而达到“宣肺以平喘，温阳以补肾”标本兼治的目的，这是课题组首次就阳和平喘颗粒治疗支气管哮喘的疗效机制进行比较分析，为后期深入研究其作用机制奠定了基础。

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Effects of Yanghe Pingchuan granules on the expression of IL-17，TNF-α and IFN-γ in rat asthma serum

DING Wei-wei1，YANG Cheng2，XU Zeng-mei1，TONG Jia-bing2，LU Mei1，TONG Xiang-li1，LI Ze-geng1
（1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

［Objective］To investigate the effects of Yanghe Pingchuan granules on the expression level of IL-17，TNF-α and IFN-γ in rat asthma serum.［Methods］Ninty SD rats were randomly divided into six groups which were normal group（N group），model group（M group），low，middle and high-dose of Yanghe Pingchuan group （YHPC-L，YHPC-M and YHPC-H group）and dexamethasone group（DXM group）.For inducing asthma，the rats were sensitized by intraperitoneal injection with ovalbumin（OVA），and then activated by inhalation.Furthermore，dexamethasone was applied to replicate kidney-deficiency rat asthma model，while the N group were treated with saline as a control.HE staining was used to evaluate the pathological changes of lung tissue in each groups，ELISA was used to detect changes of IL-17，TNF-α and IFN-γ in the rat serum.［Results］The expression of IL-17 and TNF-α is significantly higher in M group than in N group，but IFN-γ is obviously lower.Compared with M group，the levels of IL-17 and TNF-α decreased notably（P＜0.01），while IFN-γ levels increased（P＜0.01）.The effect of Yanghe Pingchuan Granules on IL-17 and TNF-α is lower than DXM（P＜0.01），whereas is stronger than DXM on IFN-γ（P＜0.01）.［Conclusion］Yanghe Pingchuan granules could cure bronchial asthma by anti-inflammatory，enhancing immunity and reducing pathological changes.

Bronchial asthma；Yanghe Pingchuan granules；Dexamethasone；IL-17；TNF-α；IFN-γ

R562.25

A

1673-9043（2015）03-0148-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.06

国家自然科学基金项目（81373598）。

丁伟伟（1987-），女，硕士研究生，主要从事中医药防治呼吸系统疾病相关研究工作。

李泽庚，E-mail：li6609@126.com。

（2015-01-31）